Fakulteten för hälso- och livsvetenskap

Transkript

1 Fakulteten för hälso- och livsvetenskap Examensarbete Jämförelse av resultat mellan manuell gelkortsanalys och automatisk immunohematologisk gelkortsanalys vid utförande av blodgruppskontroll och antikroppsscreening (BAS-test) Veronica Nilsson Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå Nr: 2013:BL12

2 Jämförelse av resultat mellan manuell gelkortsanalys och automatisk immunohematologisk gelkortsanalys vid utförande av blodgruppskontroll och antikroppsscreening (BAS-test) Veronica Nilsson Examensarbete, biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng Filosofie kandidatexamen Handledare: Ingvar Rydén MD, PhD Länsenheten för Klinisk kemi Kalmar länssjukhus SE Kalmar Roche Diagnostics Karlsbodavägen 30, Box Bromma Susanne Widell Dr Med Vet. Examinator: Maria Mattsson Dr Med Vet. Institutionen för kemi och biomedicin Linnéuniversitetet SE Kalmar Institutionen för kemi och biomedicin Linnéuniversitetet SE Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 högskolepoäng SAMMANFATTNING Oförenlighet mellan givare och mottagare vid blodtransfusion kan leda till fatala hemolytiska transfusionsreaktioner (HTR), njurskada och död samt immunisering av mottagaren. Antigener på erytrocyters yta inom ABO-systemet, samt reguljära naturliga antikroppar mot dessa i patientens plasma är viktigast att ta hänsyn till. En individ har alltid en antikropp av IgM i sin plasma mot det antigen inom ABO systemet som denne saknar. Irreguljära antikroppar, förvärvade genom transfusion eller graviditet och verksamma i kroppstemperatur orsakar också HTR vid oförenlighet. Vid blodtransfusion utförs därför alltid en blodgruppskontroll av patientens ABO antigen och antigen D inom Rh- systemet samtidigt med en antikroppsscreening av patientens plasma (BAS-test) med manuell gelkortsteknik. Immunohematologi 1000 (IH-1000) är ett helautomatiskt datoriserat system som utför denna test automatiskt och överför resultaten direkt in i patientens journal. För att undersöka om dessa metoder ger jämförbara resultat utfördes BAS-test på venprov från sammanlagt 118 blodgivare och patienter (50 män och 68 kvinnor), år, med dels manuell gelkortsteknik och dels med IH Resultaten visade en god överensstämmelse (100%) mellan de båda teknikerna avseende både ABO tillhörighet på erytrocyter och fynd av irreguljära antikroppar i plasma. De patienter som erhöll positiv antikroppsscreen med gelteknik erhöll även en positiv antikroppscreen med erytrocyter från samma testgivare vid analys i IH Ingen signifikant skillnad (chi2-test) sågs i antikroppsreaktionernas styrka mellan de båda metoderna. BAS-test kan således utföras med IH-1000 istället för manuellt i gelkort.

3 ABSTRACT Incompatibility between donors and recipients can cause fatal hemolytic transfusion reactions (HTR), kidney damage and death and immunization of the recipient. Antigens on the surface of erythrocytes in the ABO blood group system and regular natural antibodies against these in the patient s plasma must be considered. An individual always has a corresponding antibody of IgM in their plasma. Irregular antibodies acquired by transfusion or pregnancy and active in body temperature also cause the HTR incompatibility. Before blood transfusion a test is performed to investigate the patient s ABO antigen and the antigen Rh D, and an antibody screen, a compability test called BAS-test. The test is manual performed using a gel card technique. Immunohematology 1000 (IH-1000) is a fully automatic computerized system that automatically performs the test and passes the results directly to the patient file. To investigate whether these methods provide comparable results blood sample from the vein from a total of 118 blood donors and patients (50 men and 68 women) in the ages of years were collected. Both manual gel card technique and analysis with the IH-1000 were performed. The results showed a good agreement (100%) between the two techniques for both affiliation of ABO of erythrocytes and findings of irregular antibodies in plasma. The patients who received a positive antibody screen with the manual technique also received a positive antibody screen with erythrocytes from same test donor in the analysis of IH Between the two methods no clinically significant difference was observed in the antibody response in the strength of the reactions. BAS-test can be performed with IH-1000 instead of manually performed technique.

4 Innehållsförteckning INTRODUKTION... 1 Blodgruppsantigen... 1 Rh-systemet... 2 Kell-systemet... 2 Blodgruppsantikroppar... 3 Förenlighetsprövning... 3 Blodgruppsserologiska tekniker... 3 Testerytrocyter och antigram... 4 Antihumanglubulintekniken (AHG; Coomb s test)... 4 Direkt antiglobulintest (DAT)... 4 Indirekt antiglobulintest (IAT; Coomb s indirekta test)... 4 Blodgruppering och antikroppsscreening med gelkort... 5 Manuell BAS/BKS-test... 6 Automatisk gelkortanalys med Immunohematologi 1000 (IH-1000)... 6 Instrumentöversikt... 6 IH-Com Client... 7 ProSang... 7 IH-Com Communicator... 7 Syfte... 7 MATERIAL OCH METOD... 7 Provmaterial... 7 Manuellt BAS/BKS-test med gelkort... 7 Reagens och gelkort... 7 Förberedelser... 8 Kontroll... 8 Utförande... 8 IH Reagens och gelkort... 8 Inför analys... 8 Underhåll... 9 Kvalitetssäkring... 9 Testprocess... 9 Statistisk analys Etik RESULTAT DISKUSSION Slutsats TACKORD REFERENSER BILAGA 1. BILAGA 2.

5 INTRODUKTION Ett blodgruppsantigen definieras som en kemisk substans på erytrocytens yta som kan kännas igen av en specifik alloantikropp. Strukturer med liknande substans och sammansättning kan vidare grupperas i olika blodgruppssystem. Enligt The International Society of Blood Transfusion (ISBT) finns 285 godkända blodgruppsantigen. Av dessa blodgruppsantigen är 245 indelade i 29 blodgruppsystem där ABO-systemet anses vara det viktigaste inom transfusionsmedicin. Blodgruppssystemen bygger alla på skillnader i antigenstrukturer på erytrocyters yta. Denna upptäckt gjordes år 1901 då Karl Landsteiner uppmärksammade hemagglutinationsreaktioner genom att blanda olika kombinationer av erytrocyter och serum från olika individer. Det kliniskt mest relevanta blodgruppssystemet, ABO, hade identifierats och blodtransfusion kunde utföras med en lägre risk för hemolytiska transfusionsreaktioner (HTR) och allvarliga komplikationer (1-4). Blodgruppsantigen ABO-systemet utgörs av antigen A och B som ingår i tre allelsystem och är produkter av A- respektive B-allelen på ABO-genen. Allel O producerar ej något A- eller B-antigen och är recessiv till A och B. Systemet är uppdelat efter de fyra fenotyperna A, B, AB och O som i sin tur utgörs av olika genotyper (tabell I). Fenotyp A indelas i A 1 och A 2 med flera. Erytrocyter av typ A 1 uttrycker A-antigenet starkare än typ A 2 (1-2). Tabell I. ABO-grupp och genotyp. ABO-grupp Genotyp O O/O A (A 1 eller A 2 ) A/A eller A/O B B/B eller B/O AB (A 1 B eller A 2 B) A/B H-substans, som uttrycks av H-antigenet är en precursorsubstans (paraglobosid) till antigen A och B. Precursorsubstansen utgörs av N-acetylgalaktosamin, D-galaktos, N-acetylglukosamin och L-fukos som är sammanlänkade (figur 1). Det socker (L-fukos) som innehar en terminal position i precursorkedjan kallas immunodominant och ger H dess blodgruppsspecificitet. Strukturerna finns på erytrocytens membran (1-4). Figur 1. H-antigenet utgör precursorstrukturen för A- och B-antigenet. (Veronica Nilsson, 2012.) 1

6 Generna för ABH-antigenen finns vid tre olika loci (ABO, Hh och Se/se) vilka producerar det specifika glykosyltransferas som adderar ett socker till precursorsubstansen för formation av olika antigen. Gener för ABO-systemet finns på kromosom 9 och gener för Hh-systemet finns på kromosom 19 (1-4). Antigen H uttrycks starkare på erytrocyter av typ O med anledning av att H-substansen ej omvandlas. Erytrocyter av typ A 2 har mindre andel av omvandlad H-substans än erytrocyter av typ A 1 och B på grund av ett mindre effektivt A-transferas (1-2). Inom ABO-systemet finns enligt Landsteiners regel alltid en motsvarande naturlig antikropp reguljärt i en persons plasma mot det antigen denna saknar. En individ som saknar A- eller B- antigen på sina erytrocyter har således antikroppar mot både A- (anti-a) och B-antigen (anti- B) reguljärt i plasma och naturligt förekommande då de inte uppstått på grund av någon känd stimulering av immunförsvaret. Vid inkompabilitet i ABO-systemet mellan mottagare och givare kan en fatal hemolytisk transfusionsreaktion uppstå med allvarliga komplikationer, njurskada och död (1-2). Rh-systemet Rh-systemet (Rhesus) vilket innehåller 50 olika definierade blodgruppsantigen är det näst viktigaste blodgruppssystemet. Upptäckter som kom att ligga till grund för systemet gjordes först i slutet av 1930-talet och inleddes med misstanke om antikroppar hos en obstetrisk patient. En hemolytisk transfusionsreaktion var då iakttagen av Levine och Stetson. Landsteiner och Wiener kunde sedan ett år efter iakttagelsen rapportera om antikroppar hos kanin och marsvin då de använde erytrocyter från rhesusapan vid transfusion (1-5). De vanligaste antigen inom systemet är D, C, c, E och e. Antigen D har störst klinisk betydelse då det är starkt immunogent. Bärare av D-antigenet på erytrocyterna benämns RhD positiva (RhD+) medan de som saknar antigenet benämns som RhD negativa (RhD-). Det finns även fall då antigenet är försvagat uttryckt (Weak D) (1-2). Risken att bli immuniserad och bilda irreguljära antikroppar mot antigen D är hög vid transfusion och graviditet och kan vara en orsak till hemolytiska transfusionsreaktioner (HTR) och hemolytisk sjukdom hos foster och nyfödda (HDFN). HDFN kan uppkomma då antikroppar mot antigen D (IgG) från en RhD negativ immuniserad moder passerar över placentabarriären till ett RhD positivt foster (1-5). Kell-systemet Utanför ABO- och Rh-systemet är irreguljära antikroppar mot antigen K inom Kellsystemet de vanligaste. De är ofta av IgG-typ och kan reagera vid 37 C vilket leder till HDFN, autoimmun hemolytisk anemi (AIHA) och akut transfusionsreaktion. Anti-K kan dock ej bilda komplement. Totalt förekommer 25 olika antigen inom Kell-systemet vilka kodas av KEL-genen lokaliserad på kromosom 7, men antigen K och k (cellano) är de viktigaste då de är av stor klinisk relevans (1-3). 2

7 Blodgruppsantikroppar Vid exponering av ett okänt antigen på en erytrocyts yta stimuleras immunförsvaret till en produktion av antikroppar. Olika antigen har olika stark immunogenicitet, det vill säga olika förmåga att starta ett immunförsvar så antikroppar bildas. Naturliga antikroppar uppstår spontant utan tidigare känd exponering och tillhör immunglobulinklassen IgM. Naturliga IgM antikroppar förekommer både reguljärt som exempel i ABO-systemet eller irreguljärt i en patients plasma. De har även förmåga att aktivera komplement men kan inte passera över placenta på grund av sin storlek (1-2). Irreguljära antikroppar av typ IgG är förvärvade och har uppstått då en persons immunförsvar kommer i kontakt med inkompatibelt erytrocytantigen, på grund av blodtransfusion eller vid graviditet. Dessa är kliniskt viktiga då de är verksamma i kroppstemperatur och kan passera placenta. Om ett fosters erytrocyter har en annan genuppsättning än moderns erytrocyter bildar moderns immunförsvar antikroppar i plasma mot något antigen som fostrets erytrocyter bär på. Andra blodgruppssystem där antigen kan ha stark immunogenicitet förutom inom Rhsystemet är antigen i blodgruppssystemen Kell och Duffy. Irreguljära antikroppar av typ IgG mot antigen A och B kan dock också uppstå om ett fosters antigen inom ABO-systemet är annorlunda än moderns. Barn mindre än 6 månader utgör ett undantag från regeln avseende både naturliga och irreguljära antikroppar i plasma då immunförsvaret inte ännu är fullt utvecklat (1-3, 5). Förenlighetsprövning Transfusion av oförenliga ABO erytrocyter resulterar i kraftig HTR som kan leda till intravasal koagulation, njurskada och död. Oförenlighet mellan mottagare och givare avseende andra blodgruppsantigen leder till aktivering av immunförsvaret, immunisering och HTR. Förenlighetsprövning genom blodgruppskontroll och antikroppsscreening (BAS-test), är därför av stor betydelse inför varje transfusion av erytrocytinnehållande blodkomponent (1-2, 8). Blodgruppsserologiska tekniker Analystekniker inom blodgruppsserologi syftar till att påvisa erytrocytantigen inom olika blodgruppssystem samt specifika alloantikroppar riktade mot något/några av dessa antigen i en patients plasma. För påvisande av erytrocytantigen används kommersiellt tillverkade antiserum med en känd specifik monoklonal eller polyklonal antikropp med känd styrka. För att påvisa eventuella alloantikroppar i en patients plasma används blodgivarerytrocyter med en känd antigenuppsättning för olika kliniskt viktiga blodgruppssystem så kallade testerytrocyter (1-2). När ett blodgruppsantigen reagerar med en antikropp uppstår en synlig antigen/antikroppreaktion, så kallad hemagglutination (agglutination) som kan variera olika i styrka och graderas från 1-4 (se tabell II). Denna reaktionsstyrka är beroende av förhållandet i koncentration mellan antigen och antikropp, temperatur och optimal miljö samt erytrocyters negativa laddning. Antikroppar av typ IgM (som till exempel de reguljära naturliga i ABOsystemet) är stora pentamerer med flera antigenbindande platser och kan därför bilda en synlig agglutination (binda minst tre olika erytrocyter med samma antigen) direkt i isoton koksaltmiljö. Optimal temperatur är 20 C eller lägre (1-2). 3

8 Vid agglutination av irreguljära antikroppar av IgG-typ, som är mindre molekyler, krävs en förstärkt reaktionsmiljö för att binda ihop erytrocyter med IgG-antikroppar på sin yta till en synlig agglutination. Detta kan till exempel ske med hjälp av sekundära antikroppar mot humant globulin (AHG) direkt eller indirekt men också genom att sänka erytrocyternas negativa laddning med hjälp av enzymer (papain) eller högproteinmiljö med exempelvis albumin. Kroppstemperatur är optimalt för att en antikropp av typ IgG ska reagera med sitt antigen (1-2). Testerytrocyter och antigram Testerytrocyter för antikroppsscreening och antikroppsidentifiering kommer från kända blodgivare och skall alla vara av blodgrupp O. De är utvalda för att presentera de flesta antigen mot vilka eventuella irreguljära antikroppar av klinisk betydelse (reagerar i kroppstemperatur) kan binda till. De utgör tillsammans en panel där förekomst eller avsaknad av ett visst antigen kan avläsas manuellt i ett så kallat antigram. Givarens uppsättning av antigen är homozygot eller heterozygot. Bestämning av antigen (fenotypning) på testerytrocyter ska vara utförd vid två olika tillfällen på olika prov från samma givare med lika reaktionsresultat. För antikroppsscreening används testerytrocyter från 2-3 stycken olika givare och för identifiering av en specifik antikropp används testerytrocyter från 14 stycken olika givare. Testerytrocyterna utgör en standardpanel vilka numreras Panelen benämns K1-14 där K står för Kalmar. I Kalmar ingår K12, K13 och K14 som testpanel i antikroppsscreening. För att erhålla en optimal rekationsmiljö är cellerna uppslammade i isoton lösning (erytrocytsuspension) i en bestämd erytrocytkoncentration (%) vald för den specifika analystekniken (8). Antihumanglubulintekniken (AHG; Coomb s test) För att påvisa antikroppar av typ IgG i en patients plasma eller bundna på en patients erytrocyter (sensibiliserade) används främst AHG-tekniken. Antikroppar mot humant immunglobulin (AHG) får indirekt reagera med immunglobuliner i patientens plasma eller direkt bundna till cellernas antigen. Komplementbildning av IgG kräver att två molekyler av IgG binder till antigenet i viss närhet av varandra (1-2, 5). Direkt antiglobulintest (DAT) DAT (även kallat Coomb s direkta test) utförs för att upptäcka irreguljära antikroppar bundna till patients erytrocytantigen. Patients erytrocyter tillsätts AHG efter att annat löst protein tvättats bort med isoton koksalt. Om en antikropp eller ett komplementprotein är bundet till erytrocyternas yta ses en synlig agglutinationsreaktion (1-2, 5). Indirekt antiglobulintest (IAT; Coomb s indirekta test) För att påvisa irreguljära antikroppar av typ IgG i patientens plasma används vanligtvis indirekt antihumanglubulinteknik (IAT). Ett antal testerytrocyter från blodgivare med känd antigenuppsättning inkuberas i 37 C med patientplasma. Eventuell irreguljär antikropp binder efter optimal tid till sitt antigen. Testerytrocyterna renas från annat löst icke bundet humant protein och tillsätts AHG som binder till humana antikroppar på erytrocyterna. Centrifugering på optimalt varvtal underlättar agglutination och därmed den synliga agglutinationsreaktionen Eventuell agglutinationsreaktion ska avläsas manuellt och graderas enligt riktlinjer ur Handbok för Blodcentraler (tabell II) (1-2, 6). 4

9 En synlig agglutination sker således i både DAT- och IAT-tekniken då de AHG-antikroppar som är bundna till eventuella IgG-molekyler på erytrocyten även binder IgG på en närbelägen erytrocyt. Båda teknikerna kan utföras i rör eller gelkort. Agglutinationen kan således ske med hjälp av en förstärkt reaktionsmiljö (1-2, 6). Tabell II. Gradering av reaktionen mellan antigen och antikroppar. Reaktion Förklaring 4+ Ett stort agglutinat med en klar bakgrund och endast få fria celler. 3+ Fler fasta agglutinat av medelstor storlek med en klar bakgrund och endast få fria celler. 2+ Rikligt av medelstora lösa agglutinat. 1+ Makroskopiskt, nästan ej synliga agglutinat. Då inga agglutinat syns vid avläsning betecknas detta; - (negativt). Vid manuellt utförande kan även graderingarna (4+), (3+), (2+) och (1+) användas. Graderingen (4+) förklaras som något svagare än 4+ men starkare än 3+. Då en kombination av agglutinat och utebliven reaktion förekommer benämns detta som blandbild (6). Blodgruppering och antikroppsscreening med gelkort Immunhematologiska tester med gelteknik introducerades år 1990 av Lapierre et al. då kort bestående av mikrobrunnar innehållande Sephadex dextrangel i storlekarna G100, G200 eller S2000 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) togs i bruk. Vid utförandet av gelteknik överförs erytrocyter och antiserum till gelkortets mikrobrunnar. Centrifugering av gelkorten gör det möjligt för erytrocyterna att tränga ner i gelen samt påskyndar dess vandring. Om motsvarande antigen finns på erytrocyternas yta sker agglutination. Stora agglutinat blir fast högst upp i gelen medan mindre agglutinat kan silas och tränga ner i gelen (1-2, 5-6). Vid gelteknik innehållande AHG sensibiliseras erytrocyterna då okänd plasma inkuberas i värme med testerytrocyter om en blodgruppsspecifik antikropp är riktad mot antigenet på erytrocyterna. Agglutination sker vid centrifugering då de sensibiliserade erytrocyterna kommer i kontakt med AHG. Figur 2 visar reaktionen mellan antigen och antikroppar i gelkortets mikrobrunnar och används tillsammans med förklaringen i tabell II (1-2, 5-6). Figur 2. Reaktion mellan antigen och antikropp visas med agglutinationsgradering (Veronica Nilsson, 2012). Se tabell II för förklaring. 5

10 Manuell BAS/BKS-test Vid BAS-test utförs kontroll av patients ABO- och Rh D-grupp (B) via antigenbestämning av erytrocyter. För att undersöka om en patient bildat irreguljära antikroppar av typ IgG i plasma utförs även en antikroppsscreening (AS) i samband med blodgruppskontrollen. Resultatet avseende patientens ABO- och Rh D-grupp måste stämma mot tidigare genomförd fullständig blodgruppering där en antigenbestämning av ABO-antigen inklusive RhD-gruppering samt bestämning av patientens reguljära ABO-antikroppar i plasma har utförts. Är det känt att patient har irreguljära antikroppar benämns testen istället för BKS-test men utförs på samma sätt (1-2,7). Vid testen används gelkort Type and Screen (DiaMed, Cressier, Schweiz) som består av mikrobrunnar med monoklonala IgM-antikroppar mot antigenerna A (anti-a), B (anti-b) och RhD (anti-d) samt tre mikrobrunnar med polyspecifikt antihumanglobulin (AHG) (kanin anti- IgG och monoklonalt anti-c3d (antikomplement)) i gelblandning. Mikrobrunnarna innehåller gel med antikroppar buffrade i saltlösning med bovint serum. Kortet reagerar inte med DVIvarianter som är en svagare variant av D-antigenet. För blodgruppskontroll överförs patienterytrocyter till mikrobrunnar med anti-a, anti-b och anti-d. Screeningen görs mot speciellt utvalda testerytrocyter vilka blandas med patientplasma. Avläsning utförs manuellt mot ljusbord eller liknande och bedömning av antigenantikroppsreaktionens styrka görs för att sedan bokföra resultatet. Negativ BAS-test innebär att erytrocytenhet kan godkännas för utlämning till patient. Positiv BAS-test innebär fynd av kliniskt betydelsefulla erytrocytantikroppar av okänd identitet och medför en vidare antikroppsutredning för att påvisa antikroppsspecifiteten. För att säkerställa ABO förenligheten utförs slutligen en datoriserad utlämningskontroll för att se om patienten har samma blodgrupp vid blodgruppering och förenlighetsundersökningen som tidigare (1-2, 4, 8). Automatisk gelkortanalys med Immunohematologi 1000 (IH-1000) Immunohematologi 1000 (IH-1000) är ett helautomatiskt system för gelkorten ID-Cards från BioRad. Instrumentent kan utföra bestämning av ABO-blodgrupper, omvänd testning (plasmagruppering), fenotypning, Rh-undergrupper, antikroppsscreening och identifiering, bestämning av enskilda antigener samt utföra DAT och mottagar-givartest. Instrumentet har kapacitet för 180 prover, 240 gelkort och 28 olika reagens. Instrumentets viktigaste funktioner är beredning av provcellssuspension, distribution av provcellssuspension, provplasma och testceller till ID-Cards, inkubering, centrifugering, ID-Cards-avläsning samt tolkning av reaktioner i enstaka mikrobrunnar. Programvaran IH-1000 ger aktuell information om pågående tester samt ger en överblick av tillgängliga resurser (reagens, diluent 2, lösningar). Vid fel i instrumentet visas felmeddelanden på pekskärmen (figur 3a) för att kunna åtgärda felet. IH-1000 används mot programvaran IH-Com Client (9). Instrumentöversikt IH-1000 utgörs bland annat av en huvuddator och en automatiserad dator. Till instrumentet finns en pekskärm med tillhörande tangentbord för manövrering i de olika programvarorna samt en streckkodläsare bland annat för manuell registrering av prover (figur 3a). För att introducera prover och reagens i instrumentet finns ett speciellt laddningsområde för inmatning av rack. Reagensrack är konstruerat för att kunna genomföra omblandning av 6

11 reagens. Gelkort inför analys förvaras i förvaringslåda för ID-Cards och kasseras efter avläsning i avfallsbehållare för ID-Cards. Även behållare för tvättlösning, systemvätska och flytande avfall finns tillgänglig. Vid analys av prov utförs arbetet i pipetteringsområdet där transportarmen förflyttar gelkort mellan håltagningsmodul, pipetteringsområde för gelkort, inkubator och instrumentets tre möjliga centrifuger (figur 3b). Instrumenten har två olika nålar, höger och vänster, som utför all dispensering av diluent, provmaterial och reagens på höger respektive vänster sida. Nålarna sköljs i tvättstationen för att undvika kontaminering och kunna kalibreras i lokaliseringsmodulen (9). IH-Com Client IH-Com client är den programvara som används för att kontrollera instrumentet. Med hjälp av programvaran är det möjligt att spåra provtagare och läsare, hantera patientdata samt test- och arbetslistan (9). ProSang Prosang är laboratoriets laboratorieinformationssystem. Programvaran (databas) används av blodcentraler för lagring av resultat från utförda serologiska tester inför eventuella transfusioner. Till exempel är information om patienters blodgrupp samt närvaro eller frånvaro av antikropp angiven i databasen (10). IH-Com Communicator För kommunikation mellan IH-1000 och laboratoriets laboratorieinformationssystemet, ProSang, används IH-Com Communicator. Efter utförd validering är det möjligt för godkända resultat att direkt överföras till ProSang (9). Syfte Syftet med denna studie var att göra en jämförelse mellan manuell gelteknik och automatisk gelkortsanalys med IH-1000 vid utförande av BAS-test inför blodtransfusion. Ger de båda metoderna överensstämmande resultat? MATERIAL OCH METOD Provmaterial Venösa blodprover togs i rör innehållande etylendiamintetraättiksyra (EDTA) på 104 stycken slumpvis utvalda blodgivare samt 14 patienter i åldrarna år (50 män och 68 kvinnor). Totalt analyserades 118 BAS-tester. Manuellt BAS/BKS-test med gelkort Reagens och gelkort En 0.8% erytrocytsuspension bereddes av testerytrocyter K12, K13 och K14 med ID-CellStab (2 %, DiaMed, Crissier, Schweiz). För genomförandet BAS/BKS-test användes ID-Gelkort DiaClon Type and Screen. Gelkortets brunnar innehöll gelsuspension med monoklonala 7

12 antikroppar mot antigenerna -A, -B och -DVI-, anti-igg (polyklonala antikroppar mot IgG från kanin) och anti-c3d (monoklonala antikroppar) (DiaMed, Crissier, Schweiz). Förberedelser Blodprover var förvarade i cirka 2-8 C och analyserades senast 3 dygn efter provtagningstillfället för att förhindra försvagning av antikropp. Inför analys var dock blodprov och samtliga reagens rumstempererade (cirka 20 C) för att undvika interferens i form av pipetteringfel. Gelkort kontrollerades med avseende på gelens utseende. Gelen bör vara intakt med ett vätskeskikt överst, luftbubblor får ej förekomma i gel och droppar får ej förekomma på folien. Kontroll För kontroll av antigenernas hållbarhet på testerytrocyterna överfördes 50 µl av testerytrocyter K12 till mikrobrunn innehållande anti-igg och anti-c3d. För att utföra kontroll mot Duffyantigenet utfördes då 25 µl anti-fy a överfördes till samma inkubationsbrunn. Gelkort inkuberades i 37 C under 15 minuter och centrifugerades vid 2000 g under 10 minuter innan avläsning. Utförande Blodprov i EDTA-rör centrifugerades vid 2000 g under 5 minuter för att erhålla plasma och packade erytrocyter. Till inkubationsbrunnar märkta Anti-IgG+C3d överfördes 50 µl 0,8 % av testerytrocyter K12, K13 och K14 i respektive brunn. Till inkubationsbrunnar med testerytrocyter tillsattes 25 µl patientplasma. Mellan gel och testerytrocyter och plasma syntes en luftspalt. Erytrocytsuspension bereddes genom att blanda 500 µl ID-CellStab (2 %) med 25 µl packade erytrocyter från patient. Till gelkortets brunnar märkta A, B och DVI- överfördes 10 µl suspension till vardera brunn. Inkubering av gelkort utfördes under 15 minuter vid 37 C och därefter centrifugerades gelkorten under 10 minuter vid 2000 g. Avläsning av reaktionerna i vardera gelkorts mikrobrunnar utfördes över belyst bakgrund. Med anledning av att BAS-test ska avspegla patientens immunhematologiska status är testet giltigt i 5 dygn med provtagningsdag inräknad. BAS-test utfördes enligt metodbeskrivning Förenlighetsprövning, BAS-test med gelkort för Länsenheten för klinisk kemi, Landstinget i Kalmar (6-8, 11). IH-1000 Reagens och gelkort ID-cellstab, testerytrocyter K12, K13 och K14, och ID-Diluent 2 till IH-1000 (DiaMed, Crissier, Schweiz) användes vid utförandet av BAS/BKS-test i IH Lågjonlösningen (LISS) ID-Diluent 2 användes vid beredning av erytrocytsuspension för att öka inbindningshastigheten mellan antigen och antikroppar. Samma gelkort, DiaClon Type and Screen (DiaMed, Crissier, Schweiz), användes vid manuellt och maskinellt utförande. Inför analys Öppnade reagens användes ej längre än 48 h i IH Reagens, gelkort och patientprover inkuberades i rumstemperatur (cirka 20 C) i 30 minuter innan användning för att undvika pipetteringsfel. 8

13 Inför analys centrifugeras prover vid 2000 g under 10 minuter. Reagens och diluent placerades i särskilda rackar. Provrör placerades i rack avsedda för rör. Racken fördes in i laddningsområde för reagens, diluent och prov och racken matades in i instrumentet. Reagens, diluenter och provers streckkoder identifierades av identifieringsstationen och transportarmen lyfte in identifierade rack till pipetteringsområdet. Instrumentets två nålar arbetade om varandra för att känna av reagensens vätskenivå. I programvaran IH-1000 kontrollerades att racken identifierades korrekt av instrumentet samt hur stor volym av reagens som fanns tillgänglig. Gelkort förvarades i ställ och placerades i förvaringslåda för gelkort i instrumentet. Transportarmen läste av det första gelkortet i varje ställ samt räknade det totala antalet gelkort. I programvaran IH-1000 kontrollerades det att gelkorten var avlästa. Underhåll Vid dagligt underhåll kontrollerades utgångsdatum på reagens, diluent, gelkort och lösningar. Nyss nämnda fylldes även på. Vid veckounderhåll bereddes nya lösningar (bilaga 1, tabell I). Slangar torkades av med isopropanol och instrumentet sköljde automatiskt genom systemet. Tid för veckounderhåll är cirka 32 minuter. Håltagningsmodul rengjordes med Rivascoop under 15 minuter, sköljdes med vatten och torkades försiktigt. Inga mekaniska delar kom i kontakt med vätskan. Kvalitetssäkring DiaMed Basic QC är humant helblod som är negativt med avseende på HBsAg (ytantigen av hepatit B-virus), HCV (heptit C-virus) och HIV I och II (humant immunbristvirus). Rören förvarades i cirka 2-8 C och hade då en hållbarhet på 7 dygn. DiaMed Basic QC Sample 1 (QC1) är A Rh D negativt och har antikroppar mot antigen D. DiaMed Basic QC Sample 2 (QC2) är B Rh D positivt har antikroppar mot antigen Fy a. Kontrollerna användes för att granska kvalitén på använda reagenser och möjliggjorde i sin tur ett immunhematologiskt resultat. Kontrollernas förväntade reaktioner godkändes innan analys utfördes. Testprocess På datorskärm visades antal provbeställning som var redo för analys eller krävde justeringar, till exempel påfyllning av reagens. Provrack placerades i laddningsområde för inmatning prov och reagens. Efter inmatning överfördes beställning av analys i datahanteringprogramvaran och begäran överfördes till IH-1000 och visades på pekskärm. När beställning utfördes förflyttade transportarmen gelkort från förvaringslåda till pipetteringsområde och transportarmens kamera läste av förekomst av eventuella bubblor i gelkortens mikrobrunnar. Håltagningsmodul gjorde hål i gelkort som sedan placerades i pipetteringsområdets block där det inkuberades vid cirka 20 C samtidigt som nål gjorde hål i diluent. Pipett dispenserade 50 µl av vardera av testcell (K12, K13 och K14) och överförde dessa till avsedda mikrobrunnar innehållande anti-igg och anti-c3d. Analys av blodprover i IH-1000 kräver att prover ej är äldre än 2 dygn. Pipetten dispenserade sedan 25 µl plasma från prov som överfördes till mikrobrunnarna med testcellerna. Erytrocyter från prov överfördes till diluent och omblandning utfördes. Av erytrocytsuspension pipetterades 12,5 µl till mikrokolonn anti-a, anti-b och anti-dvi-. Tvätt av nål utfördes i tvättstation mellan dispenseringarna. Transportarm förflyttade gelkorten till inkuberingsblock och inkubering utfördes i 37 C under 15 minuter. Transportarm förflyttade sedan gelkort till tillgänglig centrifug. Då beställning utfördes på ett ojämnt antal prover hämtade transportarmen ett gelkort som användes som motvikt vid centrifugering. Gelkorten centrifugerades vid 2000 g under 10 minuter. Transportarmen förflyttade centrifugerade gelkort till lässtationen där en kamera registrerade 9

14 agglutinationsreaktionerna. För varje mikrobrunn var kamerabilden indelad i olika sökfönster. Vidare var varje fönster uppdelat i 5 zoner (figur 3) (9). Figur 3. Indelning av avläsningszoner för registrering av agglutinationsreaktion eller utebliven agglutinationsreaktion i mikrobrunn. Reaktioner graderas som positiv i fyra steg eller negativ. Tolkningsprogramvaran tolkade resultatet. Vid eventuella avvikelser, t ex otydliga reaktioner, tilldelades mikrobrunnen ett specifikt meddelande (bilaga, tabell II) och gelkortet förflyttades till förvaringslåda för gelkort där det avlästes manuellt. Vid manuell visuell avläsning valdes lämplig reaktionsstyrka för respektive mikrobrunn. Varje enskild reaktion eller samtliga brunnars reaktioner kunde kommenteras. Avlästa kort kasserades i behållare för avfall. Avfall handskades varsamt med tanke på potentiell smittorisk. Statistisk analys För kvalitativ jämförelse mellan metoderna utfördes chi2-test, χ 2 (chi-square test) i Microsoft Excel Med testet jämfördes kvalitativa variabler vilka indelades i klasser för att utreda om det föreligger någon signifikant skillnad mellan de två metoderna, den observerade frekvensen och den förväntade frekvensen. Hypotesprövning användes och metoderna jämfördes vid signifikansnivå α = 0,05. Skillnaden anses vara signifikant, det vill säga skillnad förekommer mellan de båda metoderna, då det uträknade värdet (p) är lägre än 0,05. En jämförelse av tidsåtgången mellan manuellt och maskinellt utförande gjordes genom att mäta analystiden för 10 patientprover vid separata tillfällen. Ett medelvärde för analystid räknades sedan ut (13). Etik Patientprover vilka valdes till studien analyserades i samband med rutindiagnostik. Provmaterialet behandlades med respekt. För att skydda patienternas identitet kodades provnumren (14). RESULTAT Totalt utfördes 118 stycken BAS/BKS-tester manuellt vilka även analyserades i instrumentet IH

15 Vid manuellt utförande utfördes kontroll av testerytrocyterna K12 mot Duffyantigenet vilket gav reaktionen (+3). Vid automatiskt utförande för att kontrollera Kalmars testerytrocyter (K12, K13 och K14) användes QC 1 och QC 2. QC 1 var A Rh D negativ samt positiv för testerytrocyterna K12 och K13. QC 2 var B Rh D positiv samt positiv för testerytrocyterna K12 och K14 (tabell III). Tabell III. Resultat av analys av QC 1 och QC 2 i IH Anti-A Anti-B Anti-DVI- K12 K13 K14 QC QC Analys i IH-1000 resulterade i rådata (bilaga, tabell I) som kunde jämföras med resultat från manuellt utförda BAS-tester (tabell IV) genom att använda chi2-test. Tabell IV. Tabellen visar de variabler som användes till chi2-testet. Totalt analyserades 118 venösa blodprover med manuell (M) respektive automatisk metod (IH-1000). Gelkort Type and screen bestående av mikrobrunnar med anti-a, -B och -DVI- samt anti-igg och C3d användes. Till mikrobrunnar med anti-igg och anti-c3d användes testerytrocyt K12, K13 och K14. Reaktion M IH Anti-A Anti-B Anti-DVI- K12 K13 K14 M IH- M IH- M IH- M IH- M IH , , , , / Totalt Enligt utfört chi2-test är uträknat värde för anti-d 5,04*10-6. Värdet för de övriga testbrunnarna överstiger signifikansnivån 0,05 (tabell V). Tabell V. Utfört chi2-test efter analys i IH Anti-A Anti-B Anti-DVI- K12 K13 K14 χ² 0,16 1,0 5,04*10-6 1,0 1,0 0,98 Tidsåtgång för manuellt utförande av ett BAS/BKS-test var 31 minuter (30,9 minuter) medan tidsåtgången för att utföra analys av ett test i IH-1000 var 30 minuter (30,4 minuter). Tid för centrifugering av prov inför analys är ej inkluderad i något av fallen. 11

16 DISKUSSION Syftet med studien var att göra en jämförelse mellan manuell gelkortsteknik och automatisk immunometod vid utförande av BAS/BKS-test med gelkortsteknik för att undersöka om de båda metoderna ger överensstämmande resultat. Utförd manuell blodgruppskontroll och analys av patientprover i IH-1000 visar vid enstaka tillfällen olika reaktionsgraderingar (tabell IV). Skillnader förekom då främst mellan reaktionerna 3+ och 4+. Vid analys av patientprover anses skillnaden, i detta fall, ej vara av klinisk relevans då samtliga resultat var över 3+ (undantag negativa reaktioner och reaktioner med blandbild). Lägsta godkända gradering i gelkortets mikrobrunnar vid manuellt utförande av blodgruppskontroll är 3+. Dock kan även (3+) godkännas som gradering under förutsättningen att ytterligare undersökning (rörteknik eller fullständig ABO/Rh-gruppering) utförs (6). Efter en statistisk analys, med hjälp av chi2-test, kunde resultaten (tabell V) jämföras vid signifikansnivå 0,05. En signifikant skillnad visades endast i resultaten från mikrobrunn innehållande anti-dvi- (5,04*10-6 <0,05). Efter validering utförd av Blodcentralen i Linköping är det fastställt att anti-dvi- i gelkort av typ Type and Screen kan ge svaga reaktioner. Detta kan dock anses som acceptabelt då Rh D-grupperingen endast brukas som en kontroll på tidigare blodgruppering (15). Resultaten efter utförd antikroppsscreening visar i vissa fall en förstärkt reaktion vid analys i IH-1000 (bilaga, tabell I). I enstaka fall visas en positiv reaktion (förekomst av irreguljär antikropp) vid manuellt utförande medan analys av samma prov visar en negativ gradering i IH Efter manuellt utförd antikroppsscreening som visas positiv kan misstanke om köldantikropp föreligga. För att utesluta köldantikropp utförs idag manuell analys rutinmässigt enligt samma förfarande i miljö med temperaturen 37 C. Instrumentets arbetstemperatur är något högre än 20 C vilket har resulterat i att vissa antikroppar, troligtvis köldantikroppar, försvinner (bilaga 2, tabell I). Att en eventuell köldantikropp försvinner underlättar arbetet med tanke på att en vidare antikroppsutredning ej erfordras. Dock är köldantikroppar normalt ej av klinisk relevans vid transfusion av erytrocytenhet då de vanligen ej är påvisbara vid 37 C. I kliniskt syfte kan det trots allt vara viktigt att resultatet visas positivt för att vetskapen om kliniskt viktiga erytrocytantikroppar ej ska gås miste om. Dock är det ej av relevans att detektera alla antikroppar hos en patient utan enbart de som är kliniskt signifikanta (2, 9, 16). Vad gäller tidsåtgång för analys kan skillnaden 0,5 minuter/analys anses oanselig, manuellt (30,9 minuter) och maskinellt utförande (30,4 minuter). Större skillnader i analystid fås dock vid analys av ett stort antal patientprover då instrumentet kan utnyttja dubbla arbetsområden och utföra fler moment samtidigt. En av de största interferenserna vid analys kan vara den mänskliga faktorn som kan orsaka bland annat pipetteringsfel och förväxlingar. Genom att föra instrumentet i bruk blir det möjligt att undvika eventuella förväxlingar och pipetteringsfel samtidigt som flera prover kan hanteras vid samma tillfälle (6, 9). 12

17 Starkt hemolyserade samt starkt lipemiska prover bör ej analyseras manuellt för att undvika interferenser. Analys av hemolyserade eller lipemiska prover i IH-1000 kan ge felaktiga eller icke tolkningsbara resultat. Vid både manuellt och automatisk metod är erfordrad åtgärd omtagning av prov. Tidigare studier beträffande automatisering av immunohematologiska tekniker visar bland annat en förbättrad analyskvalité, minskning av fel vilka är orsakade av mänskliga faktorn där ibland minska fel som rör tolkning av resultat och överföring/dokumentation av resultat. Nyss nämnda orsaker innebär att automatisering av immunhematologiska metoder ger en högre säkerhet. Att tänka på är att det slutgiltiga resultatets tillförlitlighet, oavsett metod, är beroende av en korrekt tillämpning av good laboratory practice (GLP) för reagens och prov (6, 9, 16-18). Slutsats Manuellt utförande av BAS/BKS-test har visats ha en god överensstämmelse med analys av BAS/BKS-tester i IH-1000 då åtskilliga uträknade värdena, med hjälp av chi2-test, visades överstiga signifikansnivån 0,05. Genom att utföra analys i IH-1000 undviks felkällor som annars kan orsakas av den mänskliga faktorn. 13

18 TACKORD Ett stort tack till Ingvar Rydén, min externa handledare och Susanne Widell, min interna handledare. Jag vill även tacka personalen på blodcentralen i Kalmar, framför allt Anitha Petersson och Ann-Marie Helgesson. Tack för all handledning och ert stöd! 14

19 REFERENSER 1. Berséus, O och Filbey, D. Blodgruppsserologi. Örebro : u.n., Daniels, G och Bromilow, I. Blodgruppsserolog. Pozkal, Polen : Studenlitteratur AB, Mccullough, J. Transfusion Medicine Second Edition, England, Churchill Livingstone, Harmening, D M. Modern blood banking & transfusion practices. United States of America, Issit, PD och Anstee, DJ. Applied Blood Group Serology. Durham NC : Montgomery Scientific Publications, Säfwenberg, J. och Strindberg, J. Antikroppscreening, Handbok för blodcentraler. u.o. : Svensk förening för Transfusionsmedicin, Svenska Labex AB. Metodanvisning för ID-Micro Typing System. DiaClon Type+Screen. 8. Säfwenberg, J. Förenlighetsprövning. Handbok för blodcentraler. u.o. : Svensk förening för Transfusionsmedicin, LABEX Användarmanual IH-1000 & IH-com, Helsingborg Sverige. 10. Databyrån AB. ProSang Blood Bank System. Hämtad från Transfusionsmedicin, Laboratoriemedicinskt centrum i Östergötland. Förenlighetsprövning, BAS-test, i gelkort, Aylward, G och Findlay, T. SI Chemical Data. John Wiley & Sons Australia, Ejlertsson, G. Grundläggande statistik med tillämpningar inom sjukvården. Studentlitteratur, Institutet för biomedicinsk laboratorievetenskap, IBL. Institutet för biomedicinsk laboratorievetenskap. Hämtad från Alderbom, A. Validering av IH Laboratoriemedicinskt centrum i Östergötland, Transfusionsmedicin, Bajpai, M, Kaur, R och Gupta, E. Automation in Immunohematology. Asian J Transfus Sci Jul-Dec; 6(2): Dale, A. Kern och Sterling, T. Bennet. Informatics applications in blood banking. Vol 16 nummer 4, dec Delamaire M. Automation of the immunohematology laboratory. Transfus Clin Biol Jun;12(2):

20 BILAGA 1 Tabell I. Lösningar vilka användes för underhåll av IH Lösning Riskfras med tolkning Säkerhetsfras med tolkning Setup clean R35: Starkt frätade S24, S25, S26, S28: Undvik hudkontakt. Undvik ögonkontakt. Vid ögonkontakt, skölj omedelbart med mycket vatten och kontakta läkare. System liquid Cleaning liquid Isopropanol R36, R38: Irriterande för hud. Irriterande för ögon. R34, R43: Orsakar allvarliga brännskador. Kan framkalla allergi vid hudkontakt. R11, R36, R67: Högt antändligt. Irriterande för ögon. Ångor kan orsaka dåsighet och yrsel. S24, S25, S26: Undvik hudkontakt. Undvik ögonkontakt. Vid ögonkontakt, skölj omedelbart med mycket vatten och kontakta läkare. Använd lämpliga handskar. Använd personlig skyddsutrustning för ögon och ansikte. Vid olycka eller illamående tillkalla genast läkare. Läs information från tillverkaren angående återvinning. Detta material och dess förpackning ska kasseras som farligt avfall. S7, S16, S24, S25, S26: Behållare bör hållas ordentligt stängd. Håll undan från antändande källor. Undvik hudkontakt. Undvik ögonkontakt. Vid ögonkontakt, skölj omedelbart med mycket vatten och kontakta läkare (11).

21 BILAGA 2 Labnummer Manuellt 1000 Manuellt 1000 Manuellt 1000 Manuellt 1000 Manuellt 1000 Manuellt / ?/ / ,5/ (37 C) ,5/0 0 0,5/0 0 0,5/ (37 C) wd/ /0 Dp/ , Tabell I. Analys av Anti-A 118 venösa blodprover Anti-B med gelkort Anti-DVI- Type and Screen K12 (DiaMed, Crissier, K13 Schweiz). K14 Till brunnar med IgG och C3d IH-är testerytrocyt IH- K12, K13 och IH- K14 tillsatta. Analys IH- är utförd manuellt IH- samt med IH IH- 1000

22 ,

23 /0 Dp/ (37 C) ,5 1?/ ,5 0 0, (37 C) 1, ,5 3 0 wr/0, /0 Dp/ , ,5 3 3,5 4 2, , Tabell II. Tolkning av meddelande i rådata. Meddelande Förklaring? Resultattolkning ej möjlig. Kontrollera manuellt. Dp Blandbild. wf Osäkert resultat/ oklar gel. Kontrollera manuellt för främmande partiklar. wr Ej homogent område ovanför cellknappen* (röda blodkroppar eller främmande partiklar) Kontrollera manuellt. wp Kontrollera cellknappens yta. wd Oklar knapp. Kontrollera manuellt. [ ] Brunnen används inte för detta test. L Ingen vätskefördelning i brunnen. W Brunn för tolkning ej funnen. E Ingen reaktion i brunnen. E Ingen vätska ovanför gelen. *agglutinerade erytrocyter.

24 Kalmar Växjö Kalmar Tel Lnu.se