Heloderma suspectum och Heloderma horridum, de enda kända giftödlorna

Transkript

1 Uppsala universitet Institutionen för läkemedelskemi Avdelningen för farmakognosi Heloderma suspectum och Heloderma horridum, de enda kända giftödlorna Figur 1. Gilaödlan, Heloderma suspectum. Skansen akvariet, Stockholm (Fotografi av författaren, 2008) Farmakognosi 7,5 hp HT 2008 Apotekarprogrammet termin 5 Av: Srebrenka Dobrić Handledare: Anders Backlund 1

2 Namn Familjen vårtödlor, Helodermatidae, omfattar två giftiga arter: Heloderma suspectum och Heloderma horridum, trivialt kallade för gilaödlan och skorpiongiftödlan (Brehm, 1927) men kan även benämnas som gilamonster och Mexikansk giftödla (Edström, 1988). Heloderma suspectum omnämndes första gången av Cope 1869 (itis, 2008) vid gränsen mellan USA och Mexiko (Murphy et al., 2003) och Heloderma horridum beskrevs av Wiegmann 1829 (itis, 2008) i Huajintlán Mexiko. Två respektive fyra subarter existerar (Murphy et al., 2003). Moderorganismen De två arterna har ett karaktäristiskt utseende (Murphy et al., 2003) där fjällen är vårtlika på ryggen (Brehm, 1927) varav namnet vårtödlor (Murphy et al., 2003). Ödlornas kropp är svart med orange, gula, svagt rosa eller bruna prickar samt band utspridda över kroppen och svansen (Mebs, 2002). Benen är både kraftiga och korta och svansen varierar i storlek, se fig 2 och 3. Detta beror på att svansen fungerar som ett fettlager. Figur 2. Vårtlika fjäll hos Heloderma suspectum (Fotografi av författaren, 2008) Figur 3. Ödlan Heloderma suspectum, bosatt på skansen akvariet i Stockholm (Fotografi av författaren, 2008) Både Heloderma suspectum och Heloderma horridum är väldigt skygga, de tillbringar mer än 95 % av sin tid gömda (Murphy et al., 2003) under klippblock eller underjordiska gångar, se fig 4. Då ödlornas giftkörtlar är placerade i underkäken (Edström, 1988) och då de har ett kraftigt byggt huvud med en kluven tunga samt har en klumpig gång uppfattas de ofta monsterlika (Murphy et al., 2003). De två arterna förekommer i torra och varma områden (Edström, 1988) och den mest kända arten, Heloderma suspectum, finns i Mojaveöknen i södra Nevada, USA, Soronanöknen i sydvästra Arizona, USA samt Great Basin öknen, som täcker den 2

3 större delen av staten Nevada, USA. Denna art har ett rosaaktigt mönster på fjällen och kan bli upp till 50 cm lång, vilket gör den till den största ödlan i USA. Heloderma horridum är mörkare till färgen jämfört med Heloderma suspectum och dess band-och prickmönster är vitt till svagt gult i färgen. Denna art är även mycket större än sin släkting då den kan bli ända upp till 1 m lång (Mattison, 1989). Heloderma horridum hittas i ett område som sträcker sig från nordvästra Mexiko, längst den Mexikanska västkusten ända ned till Guatemala. Parningsperioden äger rum under april juni för Heloderma suspectum och äggen läggs i juli och augusti. För Heloderma horridum gäller motsvarande september oktober, samt oktober och december. Båda arterna har liknande sammansättning av föda (Murphy et al., 2003) som omfattas av marklevande fåglar, deras ägg och ungar, gnagare samt ägg från ormar och andra ödlor (Murphy et al., 2003). På grund av långsam metabolism och möjlighet till fettlagring i svansen kan dessa ödlor vara fastande under lång tid (Pianka och Vitt, 2003), se fig 4. Förutom människor består dess fiender av rävar, hökar och örnar. Figur gömd Lägg 4. Heloderma suspectum, under en sten. märke till den förtjockade svansen till höger i bilden. Skansen akvariet, Stockholm (Fotografi av författaren, 2008) Giftkörtlarna hos dessa ödlor är placerade i underkäken med fyra körtlar på varje sida (Edström, 1988) och giftet, som tillverkas där, tillförs genom gångar (Mattison, 1989) med hjälp av kapillärkraften (Pianka och Vitt, 2003). Giftet mynnar ut i underkäken i en fåra placerad i närheten av de skarpa gaddarna. Detta innebär att giftet inte injiceras i bytet utan rinner in i såret, som orsakas av gaddarna vid bett (Mattison, 2003). Vid hot och irritation utsöndras detta gift som en vit och seg massa samtidigt som ödlan gör tuggande rörelser med munnen, vilket gör att det ser ut som om den dreglar. Tuggandet gör att gaddarna omges av giftet samt att fårorna fylls (Bonett, 2000) vilket underlättar inträngandet av giftet (Edström, 1988). Ödlorna är inte aggressiva och de utgör inget hot mot människor om det inte provoceras (Pianka och Vitt, 2003). Vid bett håller de kraftigt fast vid bytet (Mebs, 2002), likt en bulldog (Pianka och Vitt, 2003) samtidigt som de tuggar. Giftet utgör en försvarsmekanism (Mattison, 1989) men kan även vara till för att försvaga bytet vid födointag (Chen et al., 2006). Ödlorna kan inte kontrollera giftets utsöndring, sekretion av giftet sker varje gång de känner sig hotade (Mattison, 1989). Historisk användning 3

4 Familjen Helodermatidae har en mångfaldig historia som dateras tillbaka 98 miljoner år, till en tid då knappt några dinosaurier fanns. De fossila lämningarna visar att de kvarvarande arterna från denna familj härstammar från en mer varierande ättling, som överlevde den period som utrotade dinosaurierna, för 65 miljoner år sedan. Under denna tid har inte ödlorna inom denna familj genomgått någon större morfologisk förändring varav de ibland betraktas som levande fossil. Släktet Heloderma har existerat åtminstone i 23 miljoner år och idag finns endast två arter kvar, Heloderma suspectum och Heloderma horridum (Murphy et al., 2003). Ödlornas gift har varit av intresse sedan 1891 men inte förrän på senare tid har dess biokemiska sammansättning delvis klargjorts (Chen et al., 2006). På grund av den naturexploatering som har förekommit under en längre tid har ödlornas hemmiljö nästan utrotats. Detta och samt att de utgör ett samlingsföremål för människor (Murphy et al., 2003) fridlyste amerikanska och mexikanska myndigheter dessa två arter 1997 (Chen et al., 2006). Ingen historisk användning av dessa ödlors gift är känd. Drogen Hur uppsamlingen av ödlornas gift sker beskrevs redan 1913 av Loeb (Mochca- Morales et al., 1990). Loebs princip går ut på att provocera ödlan till att bita i mjukt gummi eller svamp varav uppsamling av dess sekretion sker med hjälp av en pipett, placerad i andra änden av gummit. Denna metod gör det möjligt att samla upp maximal sekretion från underkäken. Mängden gift som utsöndras från körtlarna varierar med olika faktorer. Om tänderna, hos ödlan, är i dåligt skick tenderar de att spotta ut gummit varav inget tuggande sker och därmed ingen utsöndring av giftet. Det har även visat sig att ödlor som inte hade intagit föda under en längre tid utsöndrade mindre gift, trots bra tuggande. Samma sak gäller de ödlor vars gift hade uppsamlats frekvent (Loeb, 1913). Även idag sker uppsamling av giftet enligt Loebs princip (Mochca-Morales et al., 1990; Chen et al., 2006). Extraktion av giftet sker från ödlor som finns i naturreservat(chen et al., 2006) eller från ödlor som har fångats och bevarats på laboratorier (Mochca-Morales et al., 1990). Uppsamling av giftet från svampen eller gummit sker i nedkylda glasbägare, som omedelbart fryses ned och frystorkas. Isolering, separation och rening av de olika komponenterna, som finns i giftet kan bland annat utföras med hjälp av reversed-phase HPLC (Chen et al., 2006), jonbyteskromatografi (Gomez et al., 1989) och elektrofores. Komponentens kemiska och fysikaliska egenskaper avgör vilken metod som lämpar sig bäst för detta ändamål. Ofta önskas karakterisering av komponenten (Gomez et al., 1989; Mochca- Morales et al., 1990) men även bestämning av struktur och dess biologiska aktivitet (Vandermeeers et al., 1987; Morrissette et al., 1995). Ovanstående utförs då genom aminosyraanalys (Vandermeers et al., 1987; Mochca-Morales et al., 1990), sekvensanalys (Gomez et al., 1989; Morrissette et al., 1995) och in vitro studier (Vandermeeers et al., 1987; Gomez et al., 1989; Morrissette et al., 1995). Kemi Giftsammansättningen skiljer sig inte mycket åt mellan Heloderma suspectum och Heloderma horridum. Den består av en blandning av biologiskt aktiva proteiner, varav de viktigaste omfattas av hyaluronidas, kallikrein, gilatoxin (Mebs, 2002) och även exendin-4, som upptäcktes 1987 (Dove, 2002). Giftet innehåller även en del nödvändiga enzymer för nedbrytning av föda. Vidare kan spår av koppar, aluminium, järn och zink hittas (Bonnet, 2000). 4

5 Olika former av hyaluronidas kemiska struktur hos människan är känd (Chao et al., 2007) och samma gäller för kallikrein (Debela et al., 2007; Fernandez et al., 2008). Dock är detta inte tillräckligt utforskat när det gäller giftet hos giftödlorna. Gilatoxin är ett glykoprotein (Mebs, 2002), som består av en glykoliserad polypetidkedja och helotermin är en peptid som består av 223 aminosyrarester samt 8 disulfidbryggor (Combined Chemical Dictionary, 2008). Peptiden exendin består av 39 aminosyror (Gallwitz, 2006), som bildar en helixstruktur (Neidigh et al., 2001). Farmakologi Enzymet hyaluronidas spjälkar hyaluronsyra (Mebs, 2002), ett salt som finns i alla kroppens vävnader. Den högsta koncentrationen av detta salt finns mellan cellerna i lös bindväv, till exempel hud. Saltmolekylerna bildar stora nystan, som till 99 % består av vatten vilket gör att lösningen blir elastisk och viskös. Denna egenskap förloras vid spjälkning varav enzymet hyaluronidas agerar, i ödlornas gift som en spridningsfaktor, vilket främjar giftets spridning i vävnaden. Enzymet kallikrein (Mebs, 2002) frigör peptiden bradykinin genom spjälkning av vissa proteiner i blodet benämna kinninogener. Bradykinin ökar genomsläppligheten samt blodflödet i kapillärerna vilket bidrar till sänkt blodtryck. Denna peptiden stimulerar även smärtreceptorer. Gilatoxin utgör en mindre komponent i giftsammansättningen och dess funktion tros bidra till en synergisk effekt tillsammans med de övriga komponenterna i giftet (Mebs, 2002). Vidare studier av denna komponent från Heloderma horridum har visat att toxinet orsakar blödningar i inre organ, speciellt i ögat genom vilket glosögdhet (Datta och Tu, 1997), utskjutande öga, kan uppstå. Vidare undersökningar har visat att denna komponent har strukturella likheter med kallikrein, vilket innebär att även dess verkan påminner om kallikreins effekt (Datta och Tu, 1997). Vid djurförsök har också ett enzym, som spjälkar syntetiska estrar av aminosyror, observerats vilket resulterar i blödningar i inre organ. Dock är enzymets naturliga substrat okänt och dess effekt är enbart observerad vid djurförsök (Mebs, 2002). Artens Heloderma horridum giftsammansättning innehåller även ett annat toxin, helotermin (Mebs, 2002), som har studerats hos dess subart, Heloderma horridum horridum (Chemical Combined Dictionary). Dess effekt orsakar en kroppstemperatursänkning vid experiment med djurförsök (Mebs, 2002). Även hämning av kalciumkanaler i cerebrala celler har påvisats, även det vid experiment med djurförsök (Nobile et al., 1996) upptäckte forskare exendin-4 i giftet hos Heloderma suspectum (Dove, 2002). Denna peptid är en analog till hormonet GLP-1 (Habeck, 2003), glukagonlik peptid 1 varav den även har liknande funktion (Habeck, 2003). Exendin-4 har en strukturlikhet med GLP-1 upp till 52 % (Gallwitz, 2006). Upptäckten av denna peptid har idag lett till utveckling av nya potentiella preparat för behandling av diabetes, typ 1 och 2 (Habeck, 2003), bland annat den syntetiska rekombinanten exenatid (Gallwitz, 2006). GLP-1 stimulerar bland annat betacellerna i bukspottkörteln till att utsöndra insulin samt reducerar frisättningen av glukos i blodet. Hormonets aktivitet beror på glukoshalten, vid hög halt frisätts hormonet i större mängd än vid låg halt (Dove, 2002). In vitro studier och experiment på djurförsök har också visat att GLP-1 analoger kan bevara och eventuellt öka funktionen hos betacellerna i bukspottkörteln (Davidson et al., 2005) vilket leder till en långsammare utveckling av sjukdomen (Gershell, 2005). Exendin-4 har även visat sig ha en längre 5

6 halveringstid än GLP-1 (Habeck, 2003) samt inducera viktnedgång vilket ofta är gynnsamt vid typ 2 diabetes (Cefalu, 2007). Vad exendin-4 har för funktion i ödlornas gift är idag fortfarande okänt, men man vet att den inte agerar som deras GLP-1. Detta då de har ett GLP-1 i tarmen, som liknar den hos människan strukturmässigt (Ahrén, 2005). Klinisk erfarenhet Fram till år 2002 genomfördes mer än 50 kliniska prövningar av exendin-4 av företaget Amylin Pharmaceuticals (Dove, 2002). År 2003 testades substansen exenatid (Gallwitz, 2006) i tre olika samt slumpmässiga fas III-prövningar (Habeck, 2003), där substansen gavs till patienter under 30 dagar (Gallwitz, 2006). Patientgruppen omfattades av diabetes typ 2 patienter, som var under metformin och sulfonpreparat (Habeck, 2003). Exenatid administrerades via subkutan injektion (Gallwitz, 2006) och placebo användes som kontroll (Habeck, 2003). Inga allergiska reaktioner eller lokala reaktioner observerades under denna studie (Gallwitz, 2006). Exenatid, administrerat via subkutan injektion, har idag genomgått alla de tre fas IIIprövningarna hos mer än 1400 patienter. Dessa har visat att substansen är effektiv och säker vid behandling av typ 2 diabetes. Speciellt hos de patienter där behandling med övriga tillgängliga orala preparat inte anses vara tillräcklig. (Gershell, 2005). Biverkningar och toxikologi Ödlornas gift har en omedelbar verkan hos människor (Mattison, 1989) där den primära effekten är kraftig smärta följt av utveckling av ödem kring det bitna området. Ingen förlamning eller större blödning uppstår men ett blodtrycksfall, takykardi samt illamående i kombination med kräkningar, yrsel och svettningar uppstår. Svullnad i ansikte samt läppar uppkommer också. Behandlingen omfattas av injektion av antihistaminpreparat och noradrenalin (Mebs, 2002). Yrseln, smärtan och ödemet kan vara bestående i flera veckor men avtar gradvis (Bonnet, 2000). Bettet läker utan några större problem om inga sekundära infektioner uppstår. Giftet kan vara dödligt om ödlan håller fast för länge varav det är viktigt att avlägsna den. Det finns ett fåtal rapporterade dödsfall i äldre litteratur (Mebs, 2002) men inget fall med dödlig utgång finns rapporterat sen 1930 (Murphy et al., 2003). Giftets toxicitet visar ett LD 50 -värde (Bonnet, 2000), dosen som dödar 50 % av de behandlade djuren (Mulder och Dencker, 2006), på 0,82 µg/g hos Heloderma suspectum och 1,4 µg/g hos Heloderma horridum, vilket tillåts jämföras med den indiska kobran, Naja naja, som har ett värde på 0,8 µg/g (Bonnet, 2000). Det nya preparatet exenatid kan, efter administration, orsaka illamående och huvudvärk. Illamåendet är kortvarigt och uppstår endast i början av behandlingen. Antikroppsbildning mot substansen har observerats vid långvarig administration men detta har ännu inte visat sig interferera med dess effektivitet (Gallwitz, 2006). Substansen minskar också ventrikeltömningens hastighet, vilket kan påverka effekten av de läkemedel som behöver passera magen snabbt för att undvika nedbrytning där. Detta kan leda till en eventuell reduktion av deras effekt. En potentiell interaktion med läkemedel som innehåller paracetamol och warfarin kan ske men detta har inte visat sig vara kliniskt signifikant (Scully, 2008). Medicinsk användning 6

7 I april 2005 godkändes substansen exenatid (Davidson et al., 2005) av amerikanska food and drug administration, FDA, som en tilläggsbehandling för typ 2 diabetes. Exanatid används för att förbättra glukoskontrollen hos de patienter som också intar metformin och sulfonureider. Exenatid framtagen av företagen Byetta, Amylin och Eli Lilly (Davidson et al., 2005) säljs som injektionsvätska placerad i en förfylld injektionspenna (Gallwitz, 2006). Exenatid är det första preparatet i den nya substansklassen inkretiner (Cefalu, 2007), hormoner som bildas i samband med måltid i tarmslemhinnan. Inkretiner stimulerar frisättning av andra hormoner. Idag används detta begrepp framförallt för de hormoner som stimulerar frisättning av insulin, det vill säga glukagon och GLP-1. Referenser Ahrén, B. Ny strategi vid typ-2 diabetes prövas i kliniska studier. Läkartidningen 2005, 102, Brehm, A. Djurens liv: kräldjuren tionde bandet. Aktiebolaget familjeboken, Stockholm, Sweden 1927 Bonnet, MS. The toxicology of Heloderma suspectum: the Gila monster. British Homeophatic Journal 2000, 89, Cefalu, WT. Pharmacotherapy for the Treatment of Patients with Type 2 Diabetes Mellitus: Rationale and Specific Agents. Clinical Pharmacology and Therapeutics 2007, 81,

8 Chao, KL., Muthukumar, L. and Herzberg O. Structure of human hyaluronidase-1, a hyaluronan hydrolyzing enzyme involved in tumour growth and angiogenesis. Biochemistry 2007, 46, Chen, T., Kwok, H., Ivanyi, C., Shaw, C. Isolation and cloning of exendin precursor cdnas from single samples of venom from the Mexican beaded lizard (Heloderma horridum) and the Gila monster (Heloderma suspectumk). Toxicon 2006, 47, Combined Chemical Dictionary URL: Combined Chemical Dictionary URL: Davidson, MB., Bate, G. and Kirkpatrick, P. Exenatide. Nature reviews drug discovery 2005, 4, Datta, G. and Tu, AT. Structure and other chemical chracterization of gilatoxin, a lethal toxin from lizard venom. Journal of peptide research 1997, 50, Debela, M., Goettig, P., Magdolen, V., Huber, R., Scherchter NM. And Bode, W. Structural basis of the zinc inhibition of human tissue kallikrein 5. Journal of Molecular Biology 2007, 373, Dove, A. Seeking sweet relief for diabetes. Nature Biotechnology 2002, 20, Edström, A. Djurens gifter, Studentlitteratur, Lund, Sweden 1988 Fernandez, IS., Standker, L., Magert, HJ., Forssmann, WG., Gimenez-Gallego, G. and Romeo, A. Crystal structure of human epidermal kallikrein 7 (hk7) synthesized directly in its native state in E.coli: insights into the atomic basis of its inhibition by LEKTI domain 6 (LD6). Journal of Molecular Biology 2008, 377, Gallwitz, B. Exenatide in type-2 diabetes: treatment effects in clinical studies and animal study data. International Journal of clinical practice 2006, 60, Gershell, L. Type 2 diabetes market. Nature reviews drug discovery 2005, 4, Gomez, F., Vandermeers, A., Vandermeers-Piret, MC., Herzog, R., Rahte, J., Stievenart, M., Winand, J. and Christophe, J. Purification and characterization of five variants of phospholipase A 2 and complete primary structure of the main phospholipase A 2 variant in Heloderma suspectum (Gila monster) venom. European Journal of Biochemistry 1989, 186, Habeck, M. Diabetes treatments get sweet help from nature. Nature Medicine 2003, 9, 1228 Integrated Taxonomic Infomation Service 8

9 URL: containing&p_ifx=plglt&p_lang= Integrated Taxonomic Infomation Service URL: containing&p_ifx=plglt&p_lang= Loeb, L. The venom of heloderma. Carnegie Institution of Washington, Washington, US 1913 Mattison, C. Lizards of the world. Blandford Press, London, England 1989 Mebs, D. Venomous and poisonous animals. Medpharm, Stuttgart, Germany 2002 Mochca-Morales, J., Martin, BM and Possani, LD. Isolation and characterization of helothermine, a novel toxic from Heloderma horridum horridum (Mexican beaded lizard) venom. Toxicon 1990, 28, Morrissette, J., Krätzschmar, J., Haendler, B., El-Hayek, R., Mochca-Morales, J., Martin, BM, Patel, JR, Moss, RL, Schleuning, WD., Coronado, R and Possani, LD. Primary Structure and Properties of Helothermine, a Peptide Toxin that Blocks Ryanodine Receptors. Biophysicla Journal 1995, 68, Mulder, GJ. And Dencker, L. Pharmaceutical Toxicology, Pharmaceutical Press, London, England 2006 Murphy, JB and Schlager, N. Grzimek s Animal Life Encyclopedia volume 7, Thomson Gale, Canada 2003; 2:n ed. Neidigh, JW, Fesinmeyer, RM, Prickett, KS and Andersén, NH. Exendin-4 and glucagon-like-peptide 1: NMR structural comparisons in the solution and micelleassociated states. Biochemistry 2001, 40, Nobile, M., Noceti, F., Prestipino, G., Possani,.D. Helothermine, a lizard venom toxin, inhibits calcium current in cerebellar granules. Experimental Brain Research 1996, 110, Pianka, ER and Vitt, LJ. Lizards: windows to the evolution of diversity. University of California Press, London, England 2003 Scully, C. Drug interactions. British Dental Journal 2008, 204, 4 Vandermeers, A., Gourlet, P., Vandermeers-Piret, MC, Cauvin, A., De Neef, P., Rathe, J., Svoboda, M., Robberecht, P. and Christophe, J. Chemical, immunological and biological properties of peptides like vasoactive-intestinal-peptide and peptidehistidine-isoleucinamide extrated from the venom of lizards (Heloderma horridum and Heloderma suspectum). European Journal of Biochemistry 1987, 164,

10 10