Laboratoriediagnostik av svampinfektioner. Erja Chryssanthou

Transkript

1 Laboratoriediagnostik av svampinfektioner Erja Chryssanthou

2 Jäst Unicellulära Knoppande jästceller (blastosporer) Foto Dan Eshel

3 Pseudohyf, förlängda jästceller som bildar kedjor, förökning genom unipolar knoppning

4 Candida albicans äkta hyfer Bildas i närvaro av serum Växer apikalt Liknar mögelhyfer: Aspergillus och Penicillium Hjälper C. albicans att fästa och penetrera värdceller

5 Trådsvampar (mögel, dermatofyter) Multicellulära Septerade hyfer Septa med porer Aspergillus, Fusarium, dermatofytarter Osepterade hyfer zygomyceter: Absidia, Rhizomucor, Rhizopus, Mucor arter

6 Svampar Karakteristisk livscykel Olika morfologiska former Växling mellan sexuell och asexuell förökning Den sexuellt förökande svampen kallas teleomorf Den asexuella anamorf En del har flera olika typer av anamorfer (=synamorf) T.ex Pseudoallescheria boydii (teleomorf) Synanamorf Scedosporium apiospermum och Graphium eumorphum

7 Taxonomi Minst olika svampar 397 arter i Atlas of Clinical Fungi (de Hoog) Heterotrofiska eukaryota Nomenklatur Hierarkisk indelning Division :-mycota Klass :-mycetes Order :-ales Familj :-acea Genus Species

8 Kliniskt viktiga grupper Fungi (svamp) Eumycota Äkta svampar Division Zygomycota (släkten Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Absidia) Ascomycota (släkten Aspergillus, Fusarium, Candida, dimorfa svampar, dermatofyter) Basidiomycota (släkten Cryptococcus, Trichosporon, Malassezia)

9 Mikroskopi Laboratoriediagnostik Direktpåvisning av svampstrukturer i provmaterial Fluorescensmikroskopi känsligare än vanlig ljus Fluorescerande färg binder till β-glucan i cellväggen Blankofor, calcofluor white

10 Foto D. Denning

11 Nyttan med mikroskopi Snabb metod, invasiv infektion Skilja jästsvamp från Aspergillus och zygomyceter Jästceller + pseudohyfer Septerade hyfer med dikotoma (45 gr) förgreningar Aspergillus, Fusarium och Scedosporium liknar varandra Breda osepterade bandliknande hyfer hos zygomyceter Kan vara svårt Odling för zygomyceter kan vara negativ

12 Jästceller

13 Aspergillus hyfer

14 Zygomycet hyfer

15 Mikroskopi Diagnostisk för vissa dimorfa (endemiska) svampar Coccidioides immitis sferula Små Histoplasma capsulatum jästceller i magrofager

16 Histologisk undersökning Påvisande av svampstrukturer i vävnadsnitt Jäst Periodic acid schiff (PAS) Bakgrundens cellstruktur (t. ex hyfer i blodådra) Silverfärgning (Grocott s Methenamine Silver) Känsligare Aspergillus

17 Immunohistokemi Henrik Jensen (Avd för Veterinär Patobiologi, Köpenhamns Universitet) Specifika antikroppar mot Candida, Aspergillus, Fusarium och Rhizopus

18 H.E. Jensen

19 Aspergillus H.E. Jensen

20 Odling

21 Odling Blododling Okänslig markör för invasiv svampinfektion Bättre system idag BacT/Alert System (biomérieux) Bactec System (BD) Mycosis IC/F medium för svamp Likvärdiga system men Mycosis flaskan upptäcker flera fall av blandinfektion med jäst+bakterier

22 Odling 401 svenska candidemifall % C. albicans 20.2 % C. glabrata 9.0 % C. parapsilosis 3.7 % C. dubliniensis 2.0 % C. tropicalis 2.0 % C. lusitaniae 1.2 % C. krusei 1.0 % andra arter

23 Fördelning efter klinik på 304 candidemier juni 2009 vid Karolinska, Solna 43; 14% 18; 6% 16; 5% 8; 3% 7; 2% 7; 2% 1; 0% IVA 82; 27% Barn+neonatal+neoiva Kirurgi Infektion Medicin 122; 41% Urologi Hematologi+onkologi Geriatri Öron

24 Övervakningsodlingar Koloniseringsindex Antal koloniserade områden/ provtagna områden >0.5 Vilka patienter ska provtas? ECMO, brännskade-, hematologiska patienter

25 Isolering och artidentifiering viktigt Olika svampar olika känslighet för antimykotika C. albicans känslig C. glabrata nedsatt känslighet för flukonazol, itrakonazol och ofta för vorikonazol Zygomyceter naturligt resistenta mot vorikonazol och echinocandiner Cryptococcus, Fusarium, Trichosporon naturligt resistenta mot echinocandiner

26 Serologisk diagnostik Immunoelektroosmofores (IEOP)

27 Antikroppsbestämning Aspergillus IgG Aspergilloma CF-patienter

28 Antikroppsbestämning Endemiska svampar Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces, Paracoccidioides IgG 2-6 v Känslighet ca 80% Korsreaktioner Antigentest för Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces ( Serum/plasma, BAL, likvor, urin

29 Galactofuranos-antigener Svampens cellvägg Galactomannan Utsöndras vid hyfväxt Polysackarid Platelia Aspergillus ELISA (Bio-Rad) FDA godkänd EORTC/MSG fungal definitions consensus guidelines: sannolik IFI diagnos 1,3-β-D-glucan 4 kommersiella testkit Fungitell test (Cape Cod) EORTC sannolik IFI diagnos FDA godkänd 2003

30 Aspergillus cellvägg Galactomannan

31 Galactomannan antigen Aspergillus Double sandwich enzym immunoassay Ett indexvärde Provets optisk densitet delas med kitberoende tröskel serum Serum och likvor (gräns för positivt resultat 0,5), bal ( 1,0)

32 Aspergillus antigen ELISA Neg kontroll Tröskel kontroll Positivt prov Pos kontroll

33 Galactomannan Falskt positiva test GM eller molekyler som reagerar med EIA antikroppen Vissa andra svampar I mat, mjölk, Plasmalyte för Bal Bifidobacterium spp. korsreaktiva epitoper Mukosit i mag-tarmkanalen B-lactam antibiotika Piperacillin-tazobactam, amoxicillin-clavulansyra Falskt negativa test Semisyntetiska från Penicillium Anti-aspergillus antikroppar Profylax eller empirisk behandling med antimykotika

34 Galactomannan Högt negativt prediktivt värde (98,5%) (Maertens 2007) Hög specificitet (>95%) Surrogat markör för behandlingseffekt Flera studier, sjunkande antigennivåer vid positiv behandlingseffekt Upprepad screening med lung-ct och GM Mindre empirisk behandling (Maertens 2005)

35 Galactomannan Screening av serum för tidig detektion av invasiv aspergillos hos neutropena ell. stamcellstransplanterade patienter Hur bra är det för icke-hematologiska patienter? Analys av bal Känslig metod för hematologiska och ickehematologiska patienter (organtransplanterade, ICU, AIDS) Högt positivt prediktivt värde Konfirmerande diagnostisk test under pågående sjukdom

36 1-3-beta-D-Glucan antigen Candida, Aspergillus, Fusarium, Pneumocystis Ej hos zygomyceter Låga nivåer Cryptococcus Serum

37 β-glucan En proteas-zymogen-baserad kolorimetrisk kinetisk analys

38 β-glucan Varierande känslighet i olika studier Högt negativt prediktivt värde Begränsningar Data för nyfödda och spädbarn <6 mån saknas Falskt positiva testresultat Glukaninnehållande gasväv Hemodialyspatienter Antibiotika med svampursprung (piperacillin) Albumin och immunoglobuliner β-glucan reaktivitet hos P. aeruginosa, A. faecalis, S. pneumoniae

39 Cryptococcus Antigen påvisning Likvor, serum, urin Latex test Kommersiell Mycket känslig EIA test Samma känslighet som agglutination

40 Molekylär diagnostik rdna av Aspergillus target för PCR

41 PCR PCR ingår inte i EORTC definition av sannolik IFI diagnos Standardisering av metodik behövs In house Få kommersiella metoder Europeisk initiativ ISHAM: Olika PCR metoder Detektion ok DNA extraktion fungerar sämre

42 PCR Kvarvarande frågor: Optimal provmaterial Serum/plasma: fritt DNA Helblod: cell-associerad DNA Huddinge analyserar både plasma och cellfraktion Likvor: både fritt och cell-ass. DNA Biopsier (färska prov) Bal: fördel att svamp (jäst, conidia ell. hyfer) finns Kinetik av Aspergillus DNAemia i blodet Tidpunkt för provtagning