UTVÄRDERING AV FELMEDDELANDE I emm SOFTWARE VERSION TILL SYSMEX XE- 5000

Transkript

1 Hälsa och samhälle UTVÄRDERING AV FELMEDDELANDE I emm SOFTWARE VERSION TILL SYSMEX XE ELINA ABRAHAMSSON Examensarbete i Biomedicinsk Malmö högskola Laboratorievetenskap V Hälsa och samhälle 15 högskolepoäng Malmö Biomedicinsk Analytiker Programmet Maj 2011

2 UTVÄRDERING AV FELMEDDELANDE I emm SOFTWARE VERSION TILL SYSMEX XE ELINA ABRAHAMSSON Abrahamsson, E. Utvärdering av felmeddelande i emm Software Version till Sysmex XE Examensarbete i Biomedicinsk Laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö högskola: Hälsa och Samhälle, Utbildningsområde Biomedicinsk Laboratorievetenskap, Sysmex XE-5000 är en automatiserad cellräknare som utför mätningar enligt olika mätprinciper, de två som tillämpats i projektet är RF/DC(Radio Frequency/Direct Current) samt Flödescytometri med halvledarlaser. RF/DC bygger på förändringar i radiofrekventa resistansen och likspänningsresistansen. Förändringar i den radiofrekventa resistansen (RF) ger information om densiteten i cellernas inre (exempelvis kärnans storlek) och förändringar i likspänningsresistensen (DC) ger information om blodcellernas storlek. Flödescytometri definierar ett mått på cellers fysiologiska och kemiska egenskaper. Detektion av cellerna sker genom att de bestrålas med en laserstråle samtidigt som de passerar en och en i instrumentet. Informationen som fås ut från flödescytometri inkluderar spritt ljus och fluorescens. Sysmex XE-5000 arbetar med flera olika felmeddelanden, så kallade larm. Ett eller flera larm indikerar att det finns en ökad risk för förekomst av abnormala celler och kan enbart uteslutas genom en manuell differentialräkning. I studien har tre larm, vilka indikerar närvaron av onormala leukocyter, undersökts: Blasts?, Atypical Lympho? och Lympho/L_Blasts?. Syftet med projektet är att jämföra nuvarande beräkningar med en ny mjukvara (emm) för larmen och utvärdera om de ger ett mindre antal falskt positiva larm från hematologiinstrumentet Sysmex XE Prover med något av ovanstående larm valdes ut och analyserades först med nuvarande inställningar på instrumentet och därefter med de nya beräkningarna för emm. Resultatet visar på att antalet falskt positiva prover minskar och även att antalet dubblettlarm minskar. Nyckelord: Lympho/L_Blasts?, Atypical Lympho?, Blasts?, emm, Sysmex XE

3 EVALUATION OF ERROR MESSAGES IN emm SOFTWARE VERSION TO SYSMEX XE-5000 ELINA ABRAHAMSSON Abrahamsson, E. Evaluation of error messages in emm Software Version to Sysmex XE Degree Project 15 Credit Points. Malmö University: Health and Society, department of Biomedical Laboratory Science, Sysmex XE-5000 is an automated cell counter that performs measurements with different principles. The two applied in this project are RF/DC (Radio Frequency/Direct Current) and Flow cytometry with semiconductor laser. RF/DC is based on changes in radio frequency resistance and direct current voltage. Changes in RF provide information about the density of the cell s internal structure (e.g. the nucleus) and changes in DC provide information about the size of the blood cells. Flow Cytometry define as physiological and chemical properties of the cell. Detection of cells is achieved by the irradiation with a laser beam while passing through one by one. The information obtained from flow cytometry includes scattered light and fluorescence. Sysmex XE-5000 works with several different error messages, so-called alarm. One or more alarm indicates that there is an increased risk for the presence of abnormal cells and this can only be ruled out by a manual differential count. In this study three alarms, which indicate the presence of abnormal white blood cells, were analyzed: Blasts?, Atypical Lympho? and Lympho/L_Blasts?. The project aims to compare the current calculations with the new software (emm) for the alarms and evaluate if they provide a smaller number of false positive alarms from the hematology instrument Sysmex XE Samples with one or two of the alarms were selected and analyzed with the current settings and then with the new settings for emm. The result showed that the number of false-positive samples was reduced and that the number of duplicate alarms decreased. Keywords: Lympho/L_Blasts?, Atypical Lympho?, Blasts?, emm, Sysmex XE

4 INNEHÅLLSFÖRTECKNING INLEDNING 5 RF/DC 5 Flödescytometri med halvledarlaser 6 Sidoflourescence 6 Framåt- och Sidospritt Ljus 6 Felmeddelande 6 Q-Flag 7 efficient Multichannel Messaging (emm) 7 Blasts? 7 Lympho/L_Blasts? 8 Atypical Lympho? 8 Q-Flag 8 Syfte 8 MATERIAL OCH METOD 9 Material 9 Metod 9 RESULTAT 10 DISKUSSION 18 SLUTSATS 19 REFERENSER 21 BILAGOR 23 4

5 INLEDNING Automatiserade cellräknare introducerades första gången 1953 av Wallace Coulter [1], mest känd för Coulterprincipen TM. Coulterprincipen är en referensmetod för att räkna och bestämma storlek på små partiklar [2]. Sedan 1950-talet har automatiserade cellräknare (instrument) alltmer ersatt mikroskop som förstahandsval för differentialräkning av de olika blodcellerna [1, 3]. Genom att använda automatiserade cellräknare är syftet att minska behovet av manuell differentialräkning av leukocyter men ändå behålla en optimal diagnostisk säkerhet [4]. Ett instrument måste ha en tillförlitlig detektering av patologiska blodprover samt en god screening av normala prover [4]. Cellräknare har en fördel gentemot mikroskopet då de är snabbare och har större känslighet [1]. Känsligheten är störst för prover som uppvisar enbart kvantitativa avvikelser. Kvalitativt avvikande prover, exempelvis de som innehåller abnormala och omogna celler, kräver ofta en manuell differentialräkning [1, 3]. När författaren skriver om positiva prover syftar det på prover där abnormala celler kan förekomma. Negativa prover syftar på prover där instrumentet inte har hittat abnormala celler och är så kallade normala prover. En positiv manuell differentialräkning syftar på prover där celler utöver de fem normala cellklasserna, neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, basofila granulocyter, lymfocyter samt monocyter, förekommer. En negativ manuell differentialräkning syftar på prover som enbart innehåller de fem normala cellklasserna. Enligt Jönsson 1 är Sysmex XE-5000 ekvivalent med föregångaren Sysmex XE Sysmex XE-5000 utför mätningar enligt flera olika mätprinciper, de två som tillämpats i projektet är RF/DC(Radio Frequency/Direct Current) samt Flödescytometri med halvledarlaser [5]. RF/DC RF/DC bygger på förändringar i radiofrekventa resistansen och likspänningsresistansen. Förändringar i den radiofrekventa resistansen (RF) ger information om densiteten i cellernas inre (exempelvis kärnans storlek) och förändringar i likspänningsresistansen (DC) ger information om blodcellernas storlek. RF/DC tillämpas i Immature Myeloid Information-channel (IMI- kanalen) på Sysmex XE-5000 [6]. I IMI-kanalen registreras omogna myeloiska celler [5], blaster och hematopoetiska stamceller [6]. Instrumentet utnyttjar reagens vars främsta uppgift är att lysera erytrocyter då de återfinns i större koncentration är leukocyter i helblod. Reagenset som instrumentet använder angriper lipider i granulocyternas cellmembran. Det lyserar cellmembranet hos mogna granulocyter vilket resulterar i att kärnan exponeras medan det skyddar omogna granulocyter från lysering. Detta medför att mogna och omogna celler kan skiljas ut från varandra och uppkommer på olika områden i IMI scattergrammet. Efter lysering passerar cellerna en detektor där signalerna från varje enskild cell detekteras. Från 1 Muntligt meddelande vid handledning av examensarbete

6 storleken på pulserna från RF- och DC-signalerna erhålls ett scattergram, se bilaga 1 [7]. Flödescytometri med halvledarlaser Flödescytometri definierar cellers fysiologiska och kemiska egenskaper. Detektion av cellerna sker genom att de bestrålas med en laserstråle samtidigt som de passerar en och en i instrumentet. Informationen som fås ut med flödescytometri inkluderar spritt ljus och fluorescens [7]. Metoden används för automatisk differentialräkning i den s.k. DIFF-kanalen, där neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, basofila granulocyter, lymfocyter, och monocyter detekteras [6] och erhålls i ett scattergram, se bilaga 1a och 1b [7]. Precis om i RF/DC utnyttjar instrumentet reagens för detektion av leukocyterna. Dess främsta uppgift är att lysera erytrocyterna som återfinns i mycket större koncentration än leukocyterna. Instrumentet nyttjar två olika reagens: Reagens ett lyserar erytrocyter och trombocyter [8], samtidigt som det bidrar till öppningar i leukocyternas cellmembran [5]. Reagens två innehåller ett fluorescerande färgämne, vilket kan passera in i cellerna genom de öppningar reagens ett bidragit till. Reagens två binder och färgar in nukleinsyran och organellerna [5]. Sysmex XE-5000 utnyttjar flödescytometri med halvledarlaser och detekterar celler på tre olika sätt: forward scatter, side scatter samt sidofluorescens [7]. Kombinationen av forward scatter, side scatter och sidofluorescens för kärnförande celler ger en tydlig beskrivning av varje enskild blodcell i provet [9]. Sidofluorescens När fluorescerande material belyses uppkommer ljus med längre våglängd än den ursprungliga. Mätning av fluorescens ger information om graden av färgade blodceller då en ökad ljusintensitet beror på ökad koncentration av färgämnet. Sysmex XE-5000 detekterar fluorescens i sidled [7]. Forward scatter och Side scatter När ljus träffar blodkropparna sprids det åt olika håll och ger upphov till skugor. Forward scatter ger information om storlek och side scatter ger information om cellens inre (ex. kärnans storlek) [7]. Intensiteten på det spridda ljuset beror på komplexiteten av kärnans lobering och närvaron av granula i cytoplasman. Det sidospridda ljusets intensitet ökar med storleken på kärnans lobering och granulering [10]. Felmeddelande Sysmex XE-5000 är en automatiserad cellräknare som arbetar med flera olika felmeddelanden, s.k. larm. Larmen används för att indikera den möjliga närvaron av kvalitativa och kvantitativa avvikelser hos erytrocyter, leukocyter samt trombocyter. Faktorerna som bidrar till att larmen uppkommer beror på metoderna som instrumentet utnyttjar [1]. Exempelvis i DIFF-kanalen utnyttjar instrumentet cellernas spridning av ljuset samt hur mycket de fluorescerar [4], och i de fall där celler hamnar utanför sitt normala område i scattergrammet uppkommer larm [1]. Ett eller flera larm indikerar att det finns en ökad risk för förekomst av abnormala celler och kan enbart uteslutas genom en manuell differentialräkning. [1]. I denna studie har tre larm undersökts, vilka indikerar närvaron av onormala leukocyter. Larmen är Blasts? (Blaster), Atypical Lympho? (Variant 6

7 Lymfocyter/Plasmaceller) och Lympho/L_Blasts? (ormala Lymfocyter/Lymfocyt Blaster). Med nuvarande inställningar indikerar larmet Blasts? att myeloblaster kan förekomma i provet och uppkommer då sådana celler identifieras i både DIFFkanalen och IMI-kanalen [4]. Larmen uppkommer genom att instrumentet kombinerar avvikelser i mönstret på scattergrammet från DIFF-kanalen och IMIkanalen [6, 7]. Larmet Atypical Lympho? uppkommer då instrumentet detekterar HFLC (High Fluorent Leukocyte) ovanför monocyt- och lymfocytregionen i DIFF-scattergrammet, se bilaga 1b [9,11]. Lympho/L_Blasts? uppkommer då instrumentet tror att det detekterat lymfocyter med abnormalitet [7]. Det finns även andra larm på Sysmex XE-5000, vilka inte tagits i beaktning i studien, som bidrar till att prover stoppas vid instrumentet och manuell differentialräkning utförs. Två av de larmen är HFLC 2 och IG 3 [11] På klinisk kemi i Lund 4 lämnas provsvaret ut automatiskt om HFLC <1%, men då HFLC >1% stoppas provet vid instrumentet och en manuell differentialräkning utförs. IG-larm <2% går automatiskt ut från instrumentet. Då IG är 2-5% läggs en kommentar till provet att det förekommer max 5% omogna granulocyter. IG-larm >5% stoppas vid instrumentet och en manuell differentialräkning utförs. Q-Flag Q-flag är ett numeriskt värde vilket visar graden av säkerhet för larmen Blasts?, Lympho/L_Blasts? och Atypical Lympho? [4]. Den nedre gränsen för Q- flag kan justeras av laboratoriet själv men är förinställd till ett godtyckligt värde på 100 [4]. Under projektet var nedre gränsen för Q-flag satt till 70 och det maximala värdet för Q-flag är alltid 300. Prover med Q-flag under den nedre gränsen anses vara negativa och då Q-flag ligger mellan 100 och 300 visas varningen i form av ett eller två av ovanstående larm [4]. Q-Flag är ett mått på graden av abnormalitet hos celler. Det är inte ett mått på antalet celler utan på hur säkert larmet är och om resultatet är mycket eller lite patologiskt. Graderingen av larmen baseras på algoritmer i olika kombinationer. Det sker ingen korrelation mellan graderingen av Q-flag och koncentrationen av onormala celler, detta på grund av att abnormala celler beter sig olika vid olika tillfällen. Q-Flag kan därför variera från analys till analys [13]. efficient Multichannel Messaging (emm) efficient Multichannel Messaging (emm) är en ny mjukvara för larmen Blasts?, Atypical Lympho? och Lympho/L_Blasts? på Sysmex XE emm är uppdateringar i mjukvaran hos Sysmex XE-5000, vilka uppdaterar den till version (vs) Uppgraderingens bästa funktion är dess ökade larmeffektivitet, vilken uppnås genom nya algoritmer och regler. Larmen i emm kombinerar information från IMI-kanalen och DIFF-kanalen på ett annat sätt än med nuvarande metod [14]. Med den nya mjukvaran kommer Sysmex XE-5000 även att exkludera de prover där den inte kan se en distinkt HFLC population [11]. 2 High Fluorent Lymphocyte Count 3 Immature Granulocytes = Promyelocyter, Myelocyter samt Metamyelocyter [12] 4 Muntligt meddelande vid handledning av examensarbete

8 Blasts? Äldre publikationer visar att vissa prover, exempelvis från gravida kvinnor, får falskt positiva blast larm. Med nuvarande inställningar hamnar en del omogna granulocyter i blastområdet i IMI-scattergrammet vilket leder till en ökad nivå av falskt positiva prover. De nya uppgraderingarna jämför IG-beräkningar från DIFF-scattergrammet med beräkning av omogna celler i IMI-scattergrammet, vilket ska leda till att antalet falskt positiva larm reduceras [15]. De nya beräkningarna för Blasts? bygger på två algoritmer [13]. Algoritm I larmar för blaster när antalet celler i IMI-scattergrammets blastområde är förhöjt samt när antalet celler i IMI-scattergrammets IG-område är fler än antalet celler i samma område i DIFF-scattergrammet, se bilaga 2. Algoritm II larmar för blaster när antalet celler i IMI-scattergrammets IG-område är förhöjt och när det finns fler celler i IMI-scattergrammets IG-område än i DIFF-scattergrammets IGområde samt då det i DIFF-scattergrammets d-bi område är för högt cellantal och där finns fler celler än d-ai området, se bilaga 2 [13, 14]. Lympho/L_Blasts? Flaggområdet för Lympho/L_Blasts? ligger under 150 på y-axeln i DIFFscattergrammet, det vill säga det måste ligga celler i det området i scattergrammet för att larmet Lympho/L_Blasts ska uppkomma, se bilaga 1b och bilaga 3. Reglerna för Lympho/L_Blasts ändras beroende på WBC 5 [15]. Tidigare uppkom larmet enbart om antalet inräkningar på Lymf/Mono gränsen i DIFFscattergrammet överskred ett visst värde. Med emm uppkommer larmet Lympho/L_Blast? då det i Lymf/Mono gränsen i scattergrammet finns förhöjt antal celler och antalet celler överskrider referensvärdet i förhållande till WBC koncentrationen, se bilaga 3 [13,14]. Atypical Lympho? Algoritmen för Atypical Lympho? har förbättrats då enbart celler som förekommer i ett visst område i DIFF-scattergrammet klassificeras som atypiska lymfocyter, se bilaga 1b och bilaga 3. Larmet uppkommer enbart om det inte sker någon interferens med celler, exempelvis blaster från det nedre området på scattergrammet. Med emm är det en god korrelation mellan larmet och den faktiska förekomsten av High Fluorescence Lymphocytes (HFL) [15]. Kriterierna för att instrumentet ska larma Atypical Lympho? är att HFLC (High Flourent Leukocyte Count) är mer än 1% av totala WBC och att antalet celler i d-ai2 området i DIFF kanalen är över instrumentets referensområde samt att det i d-ai området ska finnas fler celler än i d-bi området, se bilaga 3 [13,14]. Q-Flag Q-flag för Blasts?, Atypical Lympho? och Lympho/L_Blasts? har också uppgraderats med de nya beräkningarna. Värdet på Q-flag för Atypical Lympho? korreleras direkt mot HFLC i de fall där det förekommer den typen av celler (exempelvis HFLC=1.5% blir Q-flag=150) [14]. Syfte Syftet med projektet är att jämföra tidigare mjukvaran för larmen Blasts?, Lymph/L_Blasts? och Atypical Lympho? med uppdaterad mjukvara (emm) 5 White Blood cell Concentration [5] 8

9 för larmen och utvärdera om de ger ett mindre antal falskt positiva larm på prover från hematologiinstrumentet Sysmex XE

10 MATERIAL OCH METOD Instrument som användes under projektet var Sysmex XE-5000 (Sysmex, Kobe, Japan), DiffMaster (DM96) (CellaVision AB, Lund, Sverige) och Zeiss Mikroskop B e och K e (Carl Zeiss AB, Oberkochen, Tyskland) Material 123 blodprov tagna i Vacutainerrör (hel- och delvolymsrör) med antikoagulantia K 3 EDTA. Proverna hade analysen B-Diff beställd och ett eller två av larmen Blasts?, Atypical Lympho? och Lympho/L_Blasts?. Proverna hade även Q-flag > 70 och var max 24 timmar gamla vid första urval. Metod Totalt samlades prover in under tre veckor och analys kördes varje dag. Under en dag samlades prover i cirka fem timmar och förvarades i rumstemperatur innan analys. Blodproverna analyserades först med nuvarande inställningar på Sysmex XE Därefter ändrades inställningarna på instrumentet till emm och det startades om. Proverna analyserades med de nya inställningarna direkt efter omstart. Hela analysgången tog cirka 20 minuter. Resultat från båda analystillfällena skrevs ut från instrumentets programvara och Q-flag för varje prov noterades. Resultat från manuell differentialräkning (utförd av legitimerad Biomedicinsk Analytiker) i CellaVisions Diffmaster (DM96) skrevs ut från dess databas. I de fall där manuell differentialräkning utförts i mikroskop, och inte i DM96, letades resultatet fram ur labbdatasystemet DecLab och skrevs ut. 24 prover fick exkluderas ur projektet då de antingen hade för låg Q-flag, jämfört med första analystillfället med nuvarande metod som låg till grund för val av prov, eller ingen fullständig differentialräkning i de fall då utstryk saknades från vårdcentraler vilka tagit provet. Detta ledde till att 99 prover togs med i studien. 10

11 RESULTAT För provtagningsdatum och tid, analysdatum och tid, WBC, larm samt Q-flag för alla prover med nuvarande inställningar se bilaga 4. I bilaga 5 presenteras provtagningsdatum och tid, analysdatum och tid, WBC, larm samt Q-flag för alla prover med emm. Fördelningen av larm med nuvarande inställningar och emm presenteras i diagram 1. Diagram 1. Fördelning av larm med nuvarande inställningar jämfört med fördelningen av larm med nya mjukvaran. 60 av 99 prover larmade både med de nuvarande inställningarna och med den nya mjukvaran. 39 av 99 prover larmade enbart med nuvarande metod och inte med den nya mjukvaran. De prover som inte larmade med den nya mjukvaran presenteras i bilaga 6. Koncentrationen (10 9 /L) av respektive celltyp som återfanns vid manuell differentialräkning av de 39 proverna återges i tabell 3. 11

12 Tabell 3. Koncentration av normalt förekommande celler (neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, basofila granulocyter, lymfocyter samt monocyter) samt abnormala celler (promyelocyter, myelocyter, metamyelocyter, plasmaceller och blaster) vid manuell differentialräkning. Promyelocyt Myelocyt Metamyelocyt Prov Neutrofila Eosinofila Basofila Lymfocyter Monocyt Plasma cell Blast < < < < <0.1 < <0.1 < <0.1 < <

13 24 av 39 prover hade, trots avsaknad av larm med den nya mjukvaran, positiv manuell differentialräkning. IG och HFLC samt om de stoppas på grund av de kriterierna presenteras i tabell 4 och diagram 2. Tabell 4. IG och HFLC för de prover som inte larmade med emm men hade positiv manuell differentialräkning. Prov IG- Larm HFLC Positiv Manuell Differential Stop räkning Negativ Manuell Differentialräkning % 0.2% X 005 1,20% 0,10% X % 0.6% X % 0.1% X 028 6,20% 1,00% X X % 1.3% X X ,90% 0,10% X X ,50% 2,00% X X 046 2,60% 0,30% X % 0.3% X % 0.1% X % 0.0% X 061 0,50% 0,20% X 064 0,50% 0,20% X % 0.5% X % 0.9% X ,70% 0,00% X X 083-0,30% X X % 0.6% X X 100 8,60% 0,10% X X 102 1,50% 0,20% X % 0.1% X 116 7,70% 0,20% X X 122 0,30% 0,70% X Diagram 2 visar antal prover som hade stoppats respektive inte stoppats på grund av andra larmkriterier. 13

14 15 av 39 prover hade en negativ manuell differentialräkning och avsaknad av larm med emm. Larm och Q-flag (med nuvarande inställningar) för de proverna presenteras i tabell 5. Tabell 5. Larm och Q-flag med nuvarande inställningar för prover med negativ manuell differentialräkning och inget larm med emm. Nuvarande metod Prov Larm Q-flag 006 Lympho/L_Blasts Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts 70 Antal prover med negativ manuell differentialräkning men larm med både nuvarande inställningar och emm samt enbart nuvarande inställningar presenteras i tabell 6 och diagram 3. Tabell 6. Prover med negativ manuell differentialräkning som larmat både med nuvarande inställningar och med emm samt enbart larmat med nuvarande inställningar. Larm i Larm i Pos. Manuel Neg. Manuell Prov nuv. emm Differentialräkning Differentialräkning 1 X X X 6 X X 8 X X X 10 X X X 16 X X X 20 X X X 22 X X X 23 X X X 25 X X 32 X X X 34 X X X 48 X X X 49 X X 55 X X X 56 X X 14

15 58 X X 62 X X 65 X X 68 X X 69 X X 90 X X X 94 X X 97 X X 98 X X X 107 X X X 112 X X 115 X X X 118 X X X 120 X X X Diagram 3. Visar fördelningen av prover som alla hade negativ differentialräkning men antingen larm enbart med nuvarande inställningar eller larm både med nuvarande inställningar och emm Antal prover med kommentar i den manuella differentialräkningen presenteras i tabell 7. 15

16 Tabell 7 visar de prover där kommentarer förekom efter manuell differentialräkning och om den manuella differentialräkningen var positiv eller negativ. Positiv Manuell Prov Differentialräkning Kommentar 018 X Förekomst av variant lymfocyter. 038 X Avvikande granulering hos eosinofila granulocyter 058 Lymfocyter - förekomst av LGL (Large Granulated Lymphocytes) 069 Förekomst av variant Lymfocyter 079 X Hypersegmenterade segmentkärniga neutrofila 102 X Hypersegmenterade segmentkärniga neutrofila 116 X Hypogranulerade segmentkärniga neutrofila Dubblettlarm, det vill säga prover med två av de aktuella larmen, var vanligt förekommande med nuvarande inställningar, diagram 4 visar skillnad i antal dubblettlarm mellan nuvarande inställning och emm. Diagram 4. Antal prover med dubblettlarm med nuvarande inställningar och emm. 16

17 DISKUSSION Av totalt 99 prover, som alla larmade med nuvarande inställningar, larmade 60 prover med den nya mjukvaran. Detta innebär att 39 av 99 prover inte larmade med den nya mjukvaran. Det är i huvudsak de 39 proverna som författaren valt att fokusera resultat och diskussion på. 24 av de 39 proverna uppvisade en positiv manuell differentialräkning trots avsaknad av något av de aktuella larmen. Som beskrivits i inledningen finns det andra larmkriterier på Sysmex XE-5000 vilka kan leda till att ett prov stoppas trots avsaknad av larm som varit av intresse i denna studie. De larmkriterierna bidrar till att 9 av 24 prover ändå hade stoppats vid instrumentet och en manuell differentialräkning hade utförts. Återigen är det viktigt att påpeka att de tre larm som ingått i projektet bara är några av de larm som Sysmex XE-5000 jobbar med. Resultatet i tabell 3 och 4 visar att hos de prover där tre eller fler varianter av abnormala celler förekom i den manuella differentialräkningen, trots avsaknad av larm, hade alla utom ett stoppats på grund av andra larmkriterier. Det prov som inte hade stoppats hade låg förekomst av omogna celler. Graden av abnormalitet hos de 15 proverna, vilka inte hade stoppats på grund av andra larmkriterier, varierade. Detta visas genom att av de 15 proverna hade fyra prover en koncentration av myelocyter och metamyelocyter på max 0,2*10 9 /L. Sex prover hade en koncentration av plasmaceller som var mindre än 0,1*10 9 /L samt hos två prover förekom myelocyter, metamyelocyter och plasmaceller i en koncentration mindre än 0,1*10 9 /L. Ett av de 15 proverna hade IG >2% men <5% vilket innebär att en kommentar att det förekommer låg grad av omogna granulocyter läggs till provet innan det lämnas ut från instrumentet. Två prover (076 och 102) blir kvar, vilka inte hade stoppats vid instrumentet samt ej lämnats ut med kommentar om förekomst av omogna granulocyter. Det bör dock påpekas att ett hundraprocentigt resultat aldrig kommer uppnås, en viss andel falskt positiva svar kommer alltid att uppkomma på instrumentet. Enligt processansvarig inom hematologi, Labmedicin Skåne, Sven Björnsson, är förekomst av abnormala celler i låg koncentration inte något avvikande för patienten utan kan förekomma vid exempelvis bakteriell infektion eller virus infektion. Detta innebär att 13 av de 15 proverna vilka saknade larm med den nya mjukvaran men hade positiv manuell differentialräkning inte är så pass avvikande att det skulle vara någon fara för patienten om svarsresultatet lämnades ut automatiskt från instrumentet. Laboratorier i Sverige delar in celler olika vid manuell differentialräkning. Exempelvis kan myelocyter och metamyelocyter räknas till den neutrofila populationen på vissa laboratorier 6 och anses då inte som någon grav onormal förekomst. På Klinisk Kemi i Lund klassificeras dock inte myelocyter och metamyelocyterna till den neutrofila granulocyt populationen, där ingår endast stav- och segmentkärniga neutrofila granulocyter. Därav kan det vara svårt att avgöra hur abnormalt det är för patienten då det förekommer myelocyter och metamyelocyter när en del laboratorier klassificerar dem till samma population som segmentkärniga och stavformiga neutrofila granulocyter. 6 Muntligt meddelande vid handledning

18 Resultatet bekräftar att de prover där differentialräkningen visade stor förekomst av omogna celler hade alla prover stoppats vid instrumentet på grund av höga HFLC-värden eller IG-larm. Prov 083 uppvisade inte ett för högt HFLC eller IGlarm utan hade stoppats på grund av ett annat larmkriterium, WBC Scattergram. Prov 083 var det enda prov som hade enbart det larmet med emm och inte larmet i kombination med andra larm vilka tagits i beaktning under projektet. 15 av de 39 prover som hade negativ manuell differential räkning och saknade larm med den nya mjukvaran, hade en Q-flag mellan 70 och 200 med nuvarande inställningar. Prover med en låg Q-flag tyder på att instrumentet inte är lika säker på förekomst av avvikande celler som för de prover med en Q-flag på 200. Differentialräkningen för de prov med låg Q-flag kan därför förväntas vara negativa. Dock hade ingen av proverna en Q-flag över 200 vilket kan tyda på att i de fall där prover har en Q-flag > 200, är resultatet av den manuella differentialräkningen oftast positiv. Som tabell 6 och diagram 3 visar hade 29 av 99 prover en negativ manuell differentialräkning. 17 av de 29 proverna hade en negativ manuell differentialräkning trots larm med både nuvarande inställningar och emm. Detta kan bero på att instrumentet ibland klassar stora lymfocyter som exempelvis blaster. Stöd för detta påvisas genom att prov nummer 058 hade en negativ differentialräkning men en kommentar om förekomst av LGL (Large Granulated Lymphocytes). Prov 069 hade inget larm och negativ manuell differentialräkning med en kommentar om förekomst av variant lymfocyter vilka klassats tillsammans med lymfocyterna (se tabell 7). Förekomsten av dubblettlarm minskade med den nya mjukvaran. Detta visas genom att det förekom 24 dubblettlarm med nuvarande inställningar, medan det endast förekom tre med emm. För de prover som hade dubblettlarm med nuvarande inställningar var det vanligast att enbart Lympho/L_Blasts? signalerades med den nya mjukvaran. Anledningen till detta beror på att instrumentet med de nya inställningarna effektivt jämförde förekomst av för högt antal celler i Lymph/Mono-gränsen i DIFF-scattergrammet med blastområdet i IMI-scattergrammet (bilaga 3). Saknas det celler i blastområdet i IMIscattergrammet larmar instrumentet Lympho/L_Blasts? och inte Blasts?. I de fall då prover larmat enbart Blasts? med nuvarande inställningar kan det även ha larmat Lympho/L_Blasts? eller Atypical Lympho?, men de två signalerna undertrycks av larmet Blasts. Den nya mjukvaran bidrar nu till att få bort falskt positiva blastlarm. Diagram 1 visar att antalet Blasts? larm har minskat markant med emm men däremot har antalet Lympho/L_Blasts? ökat lite. Detta tyder på att instrumentet med de nya inställningarna blir bättre på att jämföra information från de olika scattergrammen och istället larmar Lympho/L_Blasts? och inte Blasts?. Diagrammet visar även att dubblettlarmen minskat med emm. 18

19 SLUTSATS Resultatet visar på att antalet falskt positiva prover minskar med den nya mjukvaran, men då Sysmex XE-5000 använder sig av fler larm än de tre som utnyttjats i studien anser författaren att det kan vara av intresse att göra ytterligare studie. Dessa studier kan vara riktade mot patienter med specifika diagnoser såsom Kronisk Lymfatisk Leukemi eller Kronisk Myeloisk Leukemi, och se hur larmen fördelas. Detta för att uppnå större säkerhet i resultatet. Det visas även i studien att antalet dubblettlarm minskar med den nya mjukvaran. Enligt processansvarig inom hematologi kan laboratoriet övergå till emm då antalet larm minskar betydligt och då de falska larmen minskar så kommer uppmärksamheten att riktas mot de väsentliga larmen. 19

20 REFERENSER 1. Sireci, A, Schlaberg, R & Kratz, A (2010) A Method for Optimizing and Validating Institution Specific Flagging Criteria for Automated Cell Counters. Arch Pathol Lab Med, 134, Wallace H. Coulter Foundation (2011) Wallace H. Coulter > Kratz, A, Bengtsson, H-S, Jeanne, E. Casey H, Keefe, M. J, Beatrice, H. G, Grzybek, Y. D, Lewandrowski, B. K & Van Cott, M. E (2005) Performance Evaluation of the Cellavision DM96 System, WBC Differentials by Automated Digital Image Analysis Supported by an Artificial Neural Network. Am J Clin Pathol, 124, Herklotz, R & Huber, R. A (2001) Precision and Accuracy of the Leukocyte Differential on the Sysmex XE Sysmex Journal International, 11-1, Sysmex Corporation (2008) Automatisk hematologianalysator XE-5000, Bruksanvisning. Kobe, Japan 6. Inoue, H (1999) Overview of Automated Hematology Analyzer XE TM. Sysmex Journal International, 9-1, Ruzicka, K, Veitl, M, Thalhammer-Scherrer, R, Schwarzinger, I (2001) The New Hematology Analyzer Sysmex XE-2100 Performande Evaluation of a Novel White Blood Cell Differential Technology. Arch Pathol Lab Med, 125, Matsumoto, H (1999) The Technology of Reagents in the Automated Hematology Analyzer Sysmex XE-2100 TM Red Fluorescence Reaction-. Sysmex Journal International, 9-2, Linssen, J, Jennisse, V, Hildmann, J, Reisinger, E, Schindler, J, Malchau, G, Nierhaus, A & Wielchens, K (2007) Identification and Quantification of High Fluorescence-Stained Lymphocytes as Antibody Synthesizing/Secreting Cells Using the Automated Routine Hematology Analyzer XE Clinical Cytometry Society, 72B, Sysmex Corporation (2011) Linssen, J and Jennissen, V (2009) Identification of High Fluorescence Lymphocytes (HFL) Count on the XE-5000 with Efficient Multi-Channel Messaging (emm) as Antibody Synthesizing Cells, c.q. Plasma Cells. Sysmex Journal International, 19-1,

21 12. Fujimoto, H, Sakata, T, Hamaguchi, Shiga, S, Tohyama, K, Ichiyama, S, Wang, F & Houwen B (2000) Flow Cytometric Method for Enumeration and Classification of Reactive Immature Granulocyte Populations. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry), 42, Sysmex Sverige (2011) Sysmex Academy, Learn and progress. (Fördjupningsutbildning X-Class). 14. Löwenhav, A (2010) XE-5000 emm, BF, CM. (Sysmex Solutions) Sysmex Corporation (opublicerat material) 15. Product Management Sysmex (2009) Customer Bulletin. Product update XE-5000 emm SOFTWARE VS Tyskland: Sysmex Europe GmbH. 16. Sysmex Corporation (2009) Sysmex Superuser Training, Metodprinciper. Hamburg, Tyskland 21

22 BILAGOR Bilaga 1a: IMI-scattergram och DIFF-scattergram Bilaga 1b: DIFF-scattergram Bilaga 2: Funktionen av algoritm I och II för Blasts med emm Bilaga 3: Funktionen av algoritm för Lympho/L_Blasts och Atypical Lympho med emm Bilaga 4: Provtagningsdata med nuvarande metod. Bilaga 5: Provtagningsdata med emm. Bilaga 6: Resultatdata för de 39 prover som saknade larm med den nya mjukvaran. 22

23 Bilaga 1a Figur 1 visar hur mogna och omogna celler fördelas i IMI-scattergrammet. På Y- axeln visas radiofrekventa resistensen, det vill säga information om cellernas inre, exempelvis kärnans storlek. På X-axeln visas förändringarna i likspänningsresistansen vilken ger information om cellernas storlek. Figur modifierad från referens 16. Figur 2 visar hur mogna celler fördelas i DIFF-Scattergrammet. På Y-axeln visas fluorescens. Desto mer cellerna fluorescerar desto högre upp på Y-axeln hamnar de (se figur 3). På X-axeln visas side scatter, vilket ger information om cellernas inre såsom kärnans storlek och mängden granula. Det blå området nere till höger är en s.k. ghost-skugga där celler som ej fluorescerar hamnar såsom lipidggregat, trombocytaggregat och erytrocyter vilka ej lyserats av reagenset. Bilden hämtad från referens

24 Bilaga 1b Figur 3 visar hur DIFF-scattergrammet ser ut i de fall då omogna celler förekommer (se röd markering). Bild modifierad från referens

25 Bilaga 2 Figur 1. IMI- och DIFF-scattergram för Blasts? algoritm I. Funktionen av Algoritm I bygger på att instrumentet larmar för blaster när antalet celler i IMIscattergrammets blastområde är förhöjt samt när antalet celler i IMIscattergrammets IG-område är fler än antalet celler i samma område i DIFFscattergrammet. Bilden modifierad från referens 15. Figur 2. IMI- och DIFF-scattergram för Blasts? algoritm II. Funktionen av Algoritm II bygger på att instrumentet larmar för blaster när antalet celler i IMIscattergrammets IG-område är förhöjt och när det finns fler celler i IMIscattergrammets IG-område än i DIFF-scattergrammets IG-område samt då det i DIFF-scattergrammets d-bi område är för högt cellantal och där finns fler celler än d-ai området. Bild modifierad från referens

26 Bilaga 3 Figur 1. DIFF- och IMI-scattergram för Lympho/L_Blasts? algoritmen. Flaggområdet för Lympho/L_Blasts? ligger under 150 på y-axeln i DIFFscattergrammet, det vill säga det måste ligga celler i det området i scattergrammet för att larmet Lympho/L_Blasts ska uppkomma. Bild modifierad från referens 15. Figur 2. DIFF- och IMI-scattergram för Atypical Lympho? algoritmen. Larmet uppkommer då antalet celler i d-ai2 området i DIFF kanalen är över instrumentets referensvärde samt att det i d-ai området ska finnas fler celler än i d-bi området. Larmet uppkommer då det i Lymph/Mono gränsen i scattergrammet finns förhöjt antal celler och antalet celler överskrider referensvärdet i förhållande till WBC koncentrationen. Bild hämtad från referens

27 Bilaga 4 Nuvarande metod Provt. Prov Dat+Tid WBC Analysdat+tid (10^9/L) Larm Q-flag Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts & Lympho/L_Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Atypical Lympho 100 Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Atypical Lympho 220 Lympho/L_Blasts Atypical Lympho 120 Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Atypical Lympho 100 Lympho/L_Blasts Atypical Lympho Lympho/L_Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts & Blasts 300 Atypical Lympho & Lympho/L_Blasts Blasts & Blasts 300 Atypical Lympho Atypical Lympho Blasts & Lympho/L_Blasts

28 & Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Blasts Atypical Lympho 110 Lympho/L_Blasts Blasts & Blasts 300 Atypical Lympho Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts 300 Atypical Lympho & Blasts 300 Atypical Lympho Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Blasts 130 Atypical Lympho Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Atypical Lympho 180 Lympho/L_Blasts & Blasts Blasts 220 Atypical Lympho & Blasts Blasts Lympho/L_Blasts & Atypical Lympho

29 Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Atypical Lympho 200 Lympho/L_Blasts & Blasts Blasts Blasts 200 Atypical Lympho & Blasts 300 Atypical Lympho Blasts Blasts Blasts & Blasts & Atypical Lympho 160 Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Atypical Lympho 140 Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts Blasts 300 Atypical Lympho Atypical Lympho 210 Lympho/L_Blasts Atypical Lympho 160 Lympho/L_Blasts Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts & Blasts 300 Atypical Lympho Lympho/L_Blasts Blasts 300 Atypical Lympho Blasts Lympho/L_Blasts = Värdet utanför angivet referensintervall & = Korrigerat värde i förhållande till NRBC (kärnförande erytrocyter) 29

30 Bilaga 5 emm (efficient Multichannel Messaging) Provt. Prov Dat+Tid WBC Analysdat+tid (10^9/L) Larm Q-flag Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts & Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts & Blasts 300 Atypical Lympho & Lympho/L_Blasts

31 Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts 220 Atypical Lympho Atypical Lympho Lympho/L_Blasts Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Atypical Lympho Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Atypical Lympho Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Blasts & Lympho/L_Blasts Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts Atypical Lympho Lympho/L_Blasts Atypical Lympho & Lympho/L_Blasts

32 & Blasts Atypical Lympho Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Blasts & Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts & Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts 300 Atypical Lympho Lympho/L_Blasts = Värdet utanför angivet referensintervall & = Korrigerat värde i förhållande till NRBC (kärnförande erytrocyter) 32

33 Bilaga 6 Tabell 2. Översikt över de prover som inte larmade med emm. Nuvarande inställningar Analys Q- Analys Prov dat+tid Larm flag dat+tid Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Blasts Blasts Atypical Lympho Blasts Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts Lympho/L_Blasts Lympho/L_Blasts Blasts emm Q- Larm flag Lympho/L_Blasts 40 Lympho/L_Blasts 40 Lympho/L_Blasts 60 Lympho/L_Blasts 60 Lympho/L_Blasts 20 Lympho/L_Blasts 40 Lympho/L_Blasts 20 Lympho/L_Blasts 30 Lympho/L_Blasts 20 Lympho/L_Blasts 40 Lympho/L_Blasts 10 Lympho/L_Blasts 30 Lympho/L_Blasts 50 Lympho/L_Blasts 40 Lympho/L_Blasts 40 Lympho/L_Blasts 40 Lympho/L_Blasts 30 33