BD CHROMagar Orientation Medium

Transkript

1 BRUKSANVISNING FÄRDIGA ODLINGSPLATTOR PA Rev.: Sep 2011 BD CHROMagar Orientation Medium AVSEDD ANVÄNDNING BD CHROMagar Orientation Medium är ett oselektivt medium för isolering, direkt identifiering, differentiering och räkning av urinvägspatogener. BD CHROMagar Orientation Medium möjliggör differentiering och identifiering av Escherichia coli och Enterococcus utan ytterligare bekräftande testning. PRINCIPER FÖR OCH FÖRKLARING AV METODEN Mikrobiologisk metod. Escherichia coli, enterokocker, Klebsiella-Enterobacter-Serratia- och Proteus-Morganella- Providencia-grupperna är de organismer som oftast orsakar urinvägsinfektioner (=UVI) % av alla urinvägsinfektioner orsakas av E. coli i renkultur eller tillsammans med enterokocker. Staphylococcus saprophyticus och Streptococcus agalactiae ses, om än mera sällan, vid urinvägsinfektioner hos kvinnor. På grund av de involverade organismernas olika resistensmönster är identifiering av den aktuella bakterietypen med användning av en uppsättning biokemiska tester nödvändig för att antibiotikabehandlingen skall bli effektiv. Detta är en av de mest tidskrävande uppgifterna på laboratorier som analyserar urinprover. De oftast isolerade species- eller organismgrupperna producerar karakteristiska enzymer. Det är därför möjligt att identifiera dessa organismer ned till speciesnivå med hjälp av ett begränsat antal tester involverande fermentering och utnyttjande av substrat. 1,2 Vissa av dessa organismer producerar enzymer för metabolisering av laktos och/eller glukosider, medan andra inte producerar några av dessa enzymer. E. coli producerar till exempel enzymer för metabolisering av laktos, men är ß-glukosidasnegativ. Andra medlemmar av Enterobacteriaceae-familjen är ß-glukosidaspositiva men producerar inga enzymer för fermentering av laktos, och åter andra kan producera båda eller inga av dessa enzymer. Betaglukosidaser återfinns också hos grampositiva kocker, såsom Enterococcus spp. och Streptococcus agalactiae. Tryptofandeaminas (TDA) är ett enzym karakteristiskt för Proteus- Morganella-Providencia-gruppen. Utvärderingar av prestandan har visat att BD CHROMagar Orientation Medium är överlägset andra vanligen använda differentierande medier för isolering, differentiering och räkning av urinvägspatogener, såsom CLED-agar eller en kombination av blod- och MacConkey-agar. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium möjliggör identifiering av E. coli och enterokocker direkt på odlingsplattan; dessutom kan presumptiv identifiering av de flesta Staphylococcus saprophyticus- och S. agalactiae-stammar samt Klebsiella-Enterobacter-Serratia- (=KES) och Proteus-Morganella-Providencia-(=PMP)grupper utföras via mediets och koloniernas färg. Eftersom BD CHROMagar Orientation Medium är ett oselektivt medium kan även andra urinvägspatogener växa, men för identifiering av dessa krävs biokemiska tester. CHROMagar Orientation Medium har utvecklats av A. Rambach och säljs av BD under ett licensavtal med CHROMagar, Paris, Frankrike. Speciellt utvalda peptoner utgör näringskälla i BD CHROMagar Orientation Medium. Kromogenblandningen består av artificiella substrat (kromogener) vilka frisätter olikfärgade föreningar när de bryts ned av specifika mikrobiella enzymer. Detta möjliggör direkt differentiering av vissa species, eller påvisning av vissa grupper organismer, med minimalt behov av bekräftande tester. PA

2 REAGENSER BD CHROMagar Orientation Medium Sammansättning* per liter aqua purif. Kromopepton 16,1 g Kromogen blandning 1,3 Agar 15,0 ph 6,9 ± 0,2 *Justerad och/eller kompletterad efter behov för att uppfylla prestandakriterierna. FÖRSIKTIGHET. Endast för professionellt bruk. Plattorna får inte användas om de visar tecken på mikrobiell kontamination, missfärgning, uttorkning, sprickbildning eller annan försämring. Se skriften ALLMÄN BRUKSANVISNING för information om aseptiska förfaranden vid hantering, biorisker och bortskaffning av använd produkt. FÖRVARING OCH HÅLLBARHET Förvara plattorna mörkt vid 2 till 8 C i originalomslaget efter mottagandet fram till dess de skall användas. Överhettning och nedfrysning skall undvikas. Plattorna kan inokuleras fram till utgångsdatum (se etiketten på förpackningen) och inkuberas under rekommenderad inkubationsperiod. Plattor från öppnade 10-plattförpackningar kan användas i en vecka vid förvaring i ren miljö vid 2 till 8 C. KVALITETSKONTROLL UTFÖRD AV ANVÄNDAREN Inokulera representativa prover med följande stammar (för ytterligare information hänvisas till skriften ALLMÄN BRUKSANVISNING). Inkubera plattorna aerobt vid C i timmar i inverterat läge. Stam Escherichia coli ATCC Enterobacter cloacae ATCC Proteus mirabilis ATCC Enterococcus faecalis ATCC Streptococcus agalactiae ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus saprophyticus ATCC (=NCTC 10516) Oinokulerad Växtresultat God till utmärkt växt; mellanstora till stora kolonier, rosa till kraftigt mörkrosa, transparenta God till utmärkt växt; mellanstora kolonier, mörkblå, med eller utan violett halo God till utmärkt växt; mellanstora kolonier, bleka till beigefärgade, omgivna av en brungul till brun halo; i områden med tät växt kan mediet vara helt brungult eller brunfärgat. Svärmning är partiellt eller helt inhiberad. God till utmärkt växt; små kolonier, blågröna till blå Ganska god till god växt; mycket små till små kolonier, ljust blågröna till ljusblå, med eller utan halo God till utmärkt växt; små till mellanstora kolonier med naturlig färg (vita till krämfärgade) Ganska god till god växt; små kolonier, opaka, ljusrosa till mörkrosa Färglös till mycket ljust brungul, transparent FÖRFARANDE Tillhandahållet material: BD CHROMagar Orientation Medium (90 mm Stacker-plattor). Mikrobiologiskt kontrollerade. Material som ej medföljer: Extra odlingsmedier, reagenser och laboratorieutrustning efter behov. PA

3 Provtyper Detta medium används uteslutande för räkning och differentiering av bakterier i urin. Mittstråleurin, kateterurin eller urin tagen via suprapubisk blåspunktion kan användas (se även KLINISKA PRESTANDA OCH METODENS BEGRÄNSNINGAR). Iakttag aseptisk teknik vid tagning av urinprover. Urinen måste strykas direkt på mediet (ej senare än 2 timmar efter provtagning) eller skall förfaras i kylskåp (i högst 24 timmar) så att överväxt av infektiösa agens eller kontaminanter före inokulering av mediet förhindras. Testförfarande Användning av kalibrerade öglor eller andra tekniker som normalt används för strykning av plattor med urinprover är ett oavvisligt krav för erhållande av isolerade kolonier med typisk färg och morfologi. Ta ett prov från den ospädda, välblandade urinen med en kalibrerad ögla (0,01 eller 0,001 ml). Kontrollera att öglan är ordentligt fylld med prov. Inokulera provet längs mitten av plattan med en enstaka strykning från vilken inokulatet därefter sprids ytterligare. 6,7 Inkubera de inokulerade plattorna aerobt vid C i timmar i inverterat läge. Eftersom ljus kan förstöra kromogenerna skall exponering för ljus minimeras under inkuberingen. När färgutveckling i kolonierna väl har skett kan de utsättas för ljus. Resultat Efter inkubering skall plattorna visa isolerade kolonier i de områden där inokulatet varit korrekt spätt. Tabell 1 och Schema 1 bör användas för identifiering eller differentiering, och som vägledning för ytterligare bekräftande tester. Gramfärgning och mikroskopi kan användas för att bekräfta resultaten. Tabell 1 Vägledning för identifiering på basis av koloniernas olika färger Organism Utseende på BD CHROMagar Bekräftande tester Orientation Medium (Krävs för fortsatt differentiering) E. coli a Mellanstora till stora, rosa till kraftigt mörkrosa, transparenta kolonier med eller utan halo i det omgivande mediet KES b -gruppen PMP c -gruppen Mellanstora, blå till mörkblå kolonier med eller utan violett halo Bleka till beigefärgade kolonier omgivna av bruna halos d Enterococcus Små, blågröna kolonier S. agalactiae Ljust blågröna till blå, mycket små till små kolonier med eller utan violett halo S. saprophyticus (de flesta Ljusrosa till mörkrosa, små stammar) opaka kolonier med eller utan Övriga (inklusive jästsvampar) För fotnoterna a-h, se Schema 1 halo Naturfärgade (krämfärgade) BBLCrystal E/NF för differentiering inom genera Indol, H 2 S e, ODC f, BBL CRYSTAL E/NF för differentiering inom genera PYR g 5 µg novobiocindiskar h Lämpliga biokemiska eller serologiska tester för identifiering Bekräftande tester Utför de bekräftande tester som krävs (se tabell 1, schema 1). Detektionsreagenser skall ej påföras direkt på kolonierna på BD CHROMagar Orientation Medium. Dessa tester skall istället utföras på filterpapper med användning av växt från respektive kolonier. För E. coli-kolonier som är rosa till kraftigt mörkrosa men mycket små till små i storlek skall Kovacs indolreagens inte användas, eftersom kolonifärgen kan interferera med den röda färgen PA

4 vid positiv indoltest; använd istället dimetylaminocinnamaldehyd(dmaca)indolreagens (grönt = positivt prov). Om andra bekräftande tester eller biokemiska identifieringssystem används måste anvisningarna som medföljer dessa tester eller system följas. Bekräftande testning av Enterococcus skall endast utföras om noggrannare specificering än genusnivå krävs. Schema 1: Vägledning för utförande av identifierande tester av selekterade organismer Koloniernas utseende Små, mörkrosa, opaka Färglösa till beigefärgade kolonier, orangebrunt medium 5 µg novobiocindiskar PMP-gruppen DMACA i - indoltest PA känslig S. intermedius, S. simulans resistent S. saprophyticus, S. xylosus grön (positiv) H 2 S-positiv e H 2 S-negativ e färglösa till mörkrosa (negativ ODC-positiv f ODC-negativ f BBL CRYSTAL GP för differentiering inom genera P. vulgaris Providencia spp., Morganella spp. P. mirabilis P. penneri a Se Metodens begränsningar b KES = Klebsiella-Enterobacter-Serratia-gruppen c PMP = Proteus-Morganella-Providencia-gruppen d Den gulbruna till bruna färgen beror på positiv reaktion för tryptofandeaminas (TDA), vilket är gemensamt för alla organismer i PMP-gruppen. Cirka 50 % av P. vulgaris-stammarna producerar blå kolonier på ett gulbrunt till brunt medium. e Konventionell vätesulfidtest. f Konventionell ornitindekarboxylastest. g Pyroglutamattest för pyrrolidonylarylamidas. h Inokulera-stryk en Mueller Hinton II-agarplatta med isolatet. Placera en novobiocindisk (5 µg-disk) på den inokulerade plattan. Inkubera plattorna i timmar vid o C och bestäm hämningszonens storlek. (resistent: 16 mm, känslig: > 16 mm). i DMACA= Dimetylaminocinnamaldehydreagens för indolproduktion. Applicera reagens på ett filterpapper och gnid in en koloni i reagensområdet på filterpapperet. Vänta i sec. Grön färg är tecken på indolproduktion (röd färg eller färglös = negativt resultat). Beräkning och tolkning av resultat 6,7 Räkna antalet kolonier (CFU) på plattan. Om en 0,01 ml-ögla användes representerar varje koloni 100 CFU/mL urin, och om en 0,001 ml-ögla användes representerar varje koloni 1000 CFU/mL urin. 7 Mittstråleurin och kateterurin: Enligt aktuella riktlinjer utgör en densitet på 10 5 CFU/mL för ett enstaka isolat tecken på infektion, <10 5 CFU/mL indikerar kontamination från uretra- eller vaginalfloran, och densiteter på mellan 10 4 och 10 5 CFU/mL bör utvärderas på nytt, baserat på den kliniska informationen. 7 Kontaminerande bakterier uppträder vanligen i lågt antal med varierande kolonimorfologi. Urin tagen via suprapubisk blåspunktion: Eftersom urinblåsan hos ej infekterade personer normalt är steril utgör varje CFU-värde tecken på infektion. Urinvägspatogener ger vanligen höga värden och har enhetlig kolonimorfologi och färg på detta medium. KLINISKA PRESTANDA OCH METODENS BEGRÄNSNINGAR BD CHROMagar Orientation Medium är ett kromogent medium för direkt identifiering, differentiering och räkning av vanligt förekommande urinvägspatogener. Mediet lämpar sig för

5 isolering av många olika aerobt växande mikroorganismer, som t.ex. Enterobacteriaceae, Pseudomonas och andra icke-fermenterande gramnegativa stavar, enterokocker, stafylokocker och många andra mikroorganismer som återfinns i urinprover. Utvärderingar av prestandan har visat att BD CHROMagar Orientation Medium besitter fördelar jämfört med andra differentierande medier som används för isolering, differentiering och räkning av UVI-patogener, såsom CLED-agar eller en kombination av blod- och MacConkey-agar. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium möjliggör differentiering och identifiering av E. coli och enterokocker utan ytterligare bekräftande tester, på basis av de identifieringskriterier som fastställts i CLSI-standarden M35-A, Abbreviated Identification of Bacteria and Yeast; Approved Guideline. 8 Presumptive identifiering av S. saprophyticus, S. agalactiae, Klebsiella- Enterobacter-Serratia- (KES) och Proteus-Morganella-Providencia (PMP)-grupperna kan utföras med hjälp av kolonimorfologi, pigmentering och mediets missfärgning. Eftersom de flesta vanliga urinvägsinfektioner orsakas av E. coli och/eller enterokocker, innebär användning av detta medium att arbetsbelastningen och tidsåtgången för inokulering och avläsning av sådana identifieringssystem som krävs vid användning av konventionella odlingsmedier, avsevärt reduceras. Prestanda 4,9,10 Den mikrobiologiska prestandan hos BD CHROMagar Orientation Medium och ett kromogent medium från en konkurrent jämfördes med prestandan hos Columbia-agar med 5 % fårblod och hos MacConkey-agar utan kristallviolett, avseende räkning och presumptiv identifiering av bakterier som orsakar urinvägsinfektioner. 4 Av sammanlagt 658 kliniska urinprover uppvisade 118 prover ingen växt, 402 prover uppvisade växt med koncentrationer på 10 5 CFU/mL, och 138 prover uppvisade växt med koncentrationer på <10 5 CFU/mL. Av proverna med koncentrationer på 10 5 CFU/mL, utgjordes 163 av renkulturer och 239 av blandkulturer. Totalt 266 Escherichia coli-isolat erhölls på båda av de kromogena medierna, 260 isolerades på blodagar och 248 isolerades på MacConkey-agar. Hos en stam (0,4 %) utvecklades inte den förväntade rosa färgen på BD CHROMagar Orientation Medium, och hos 23 stammar (8,7 %) utvecklades inte den förväntade rosa färgen på konkurrentmediet. Enterokocker (BD CHROMagar Orientation Medium, n = 266; konkurrentmediet, n = 265) producerade små blågröna kolonier på de båda kromogena medierna. Femtio av blandkulturerna innehöll enterokocker som endast detekterades på de kromogena medierna. Klebsiella-Enterobacter- Serratia- (KES) och Proteus-Morganella-Providencia-(PMP)grupperna kunde identifieras på de båda kromogena medierna. Av 66 isolat i KES-gruppen växte 63 med förväntad färg på BD CHROMagar Orientation Medium och 58 av 64 isolat växte med förväntad färg på konkurrentmediet. Andra mikroorganismer krävde ytterligare tester för identifiering. I en andra utvärdering av prestandan, vari ingick totalt 421 kliniska urinprover av vilka 286 uppvisade växt av bakterier eller jästsvamp, jämfördes BD CHROMagar Orientation Medium med BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood. 9 På det kromogena mediet erhölls 483 isolat, och på blodagarmediet isolerades 447 stammar. Stammarna identifierades biokemiskt. Av E. coli-stammarna, identifierades 95 % korrekt via koloniernas rosa till mörkrosa färg, medan de återstående E. coli-stammarna var ofärgade. Alla Enterococcus spp.-isolat uppvisade den typiska blå till blågröna kolonifärgen. Streptococcus agalactiae-isolaten producerade små, ljusblå till blågröna kolonier och differentierades från enterokocker via negativ PYR-test. Alla Staphylococcus saprophyticus- och S. simulans-isolat producerade små, mörkrosa, opaka kolonier, vilka differentierades med hjälp av novobiocintest och identifierades ner till speciesnivå med hjälp av biokemiska tester. I en intern blindstudie som innefattade testning av över 900 bakteriestammar insådda i urin, var sensitiviteten och specificiteten hos BD CHROMagar Orientation Medium vad gäller identifiering av E. coli enbart efter kolonifärg och -morfologi 97 % respektive 99 %; för Enterococcus var sensitiviten och specificiten vad gäller identifiering 99 % respektive 97 %, (se tabell). 10 PA

6 Organism Sensitivitet % (95 % konfidensintervall) E. coli 277/286 96,9 % (94,1-98,6 %) Enterococcus 319/324 98,5 % (96,4-99,5 %) Specificitet % (95 % konfidensintervall) 638/645 98,9 % (97,8-99,6 %) 603/ % (95,3-98,2 %) Metodens begränsningar Eftersom detta medium är oselektivt kan andra UVI-patogener också växa. Kolonier som växer med sin naturliga färg och inte reagerar med de kromogena substraten i BD CHROMagar Orientation Medium måste differentieras ytterligare med lämpliga biokemiska eller serologiska tester. Se referenserna. 1,2 E. coli-kolonier med rosa till kraftigt mörkrosa färg men med mycket små till små kolonier, kräver ytterligare bekräftande tester, såsom indolspottest (DMACA-indolreagens). Andra gramnegativa stavar än de som ingår i KES-gruppen kan producera stora, blå kolonier på BD CHROMagar Orientation Medium och kräver ytterligare biokemisk testning för identifiering. 11 I mycket sällsynta fall kan Listeria monocytogenes eller andra Listeria-species förekomma i urinen (t.ex. vid abort orsakad av dessa agens). Listeria producerar små, blå till blågröna kolonier som är PYR-negativa, och liknar Streptococcus agalactiae. Det kan därför vara värdefullt att göra en gramfärgning av alla stammar som växer med mycket små, blå till blågröna kolonier på detta medium och som är PYR-negativa. Förekomst av grampositiva stavar kan tyda på närvaro av Listeria-species, men ytterligare biokemiska tester krävs för att bekräfta identiteten. I mycket sällsynta fall kan Aeromonas hydrophila-isolat växa med rosa till mörkrosa kolonier. Dessa kan skiljas från E. coli med hjälp av oxidastest (Aeromonas = positiv; E. coli = negativ). Koagulasnegativa stafylokocker andra än S. saprophyticus, t.ex. S. simulans, S. xylosus och S. intermedius, kan ibland växa med små, mörkrosa, opaka kolonier. Det är därför nödvändigt att utföra ytterligare tester (se Schema 1) av sådana isolat. BD CHROMagar Orientation Medium kan inte användas för odling av krävande organismer såsom Neisseria, Haemophilus eller Mycoplasma spp. Användning av detta medium till icke-kliniska prover eller andra kliniska prover än urin har inte dokumenterats. Innan BD CHROMagar Orientation Medium används för första gången rekommenderas att användaren övar sig på de typiska koloniutseendena med hjälp av kända stammar, förslagsvis de stammar som finns förtecknade under KVALITETSKONTROLL UTFÖRD AV ANVÄNDAREN. REFERENSER 1. Isenberg, H.D. (ed.) Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1. American Society for Microbiology. Washington, DC. 2. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld Bailey & Scott s diagnostic microbiology, 10 th ed. Mosby, Inc., St. Louis. 3. Merlino, J., S. Siarakas, G. J. Robertson, G. R. Funnell, T. Gottlieb, and R. Bradbury Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 34: Hengstler, K.A., R. Hammann, and A.-M. Fahr Evaluation of BBL CHROMagar Orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 35: Samra, Z., M. Heifetz, J. Talmor, E. Bain, and J. Bahar Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 36: PA

7 6. Clarridge, J.E., M.T. Pezzlo, and K.L. Vosti Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary tract infections. Coordinating ed., A.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Forbes, B.A., and P.A. Granato. Processing specimens for bacteria In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved Guideline M35. Abbreviated identification of bacteria and yeast, CLSI, Wayne, PA.Search for latest version at 9. Data on file. BD Diagnostic Systems Europe, Heidelberg, Germany. 10. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 11. Abbott, S.L Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. FÖRPACKNINGAR/TILLGÄNGLIGHET BD CHROMagar Orientation Medium Kat.nr Färdiga odlingsplattor, 20 plattor per förpackning Kat.nr Färdiga odlingsplattor, 120 plattor per förpackning YTTERLIGARE INFORMATION Kontakta närmaste BD-representant för ytterligare information. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company BD PA