Contignasterol. egenskaper som inte räckte hela vägen. - Med antiinflammatoriska. Katarina Berg. Uppsala Universitet HT- 14

Transkript

1 Contignasterol - Med antiinflammatoriska egenskaper som inte räckte hela vägen Katarina Berg Uppsala Universitet HT- 14 Biologiskt Aktiva Naturprodukter i Läkemedelsutveckling 7,5hp

2 Sammanfattning Contignasterol är en substans som hittades i den marina svampen Petrosia Contignata Thiele, Strukturutredningar visade att contignasterol var en steroid med ovanliga strukturella egenskaper såsom en cisformation mellan C/D ringarna i ringsystemet. Contignasterol visade goda antiinflammatoriska egenskaper både in vivo och in vitro men substansen var komplex och svår att få isolerat i stora mängder från ursprungsorganismen. En analog skapades; IPL576,092 som visade sig både ha bättre biologisk aktivitet samt var billigare och lättare att producera. Denna substans kom ända till fas II i kliniska prövningar som preparat mot astma. Vid detta läge såldes läkemedelsföretaget som bedrivit studierna vidare och under dessa omständigheter valdes projektet bort. Idag finns ingen information om vidare utveckling av produkten. 2

3 Innehållsförteckning Contignasterol... 1 Sammanfattning... 2 Historisk bakgrund... 4 Marina organismer i läkemedelsutveckling... 4 Steroider... 5 Hur och varför startade forskningen på contignasterol?... 5 Extraktion och isoleringsmetoder... 6 Tidig extraktion... 6 Syntes av analog... 7 Biologisk aktivitet... 7 Astma... 7 Antiinflammatorisk effekt av contignasterol och dess analog IPL576, Läkemedelsutveckling... 9 Diskussion Referenser

4 Historisk bakgrund Marina organismer i läkemedelsutveckling Växter har använts sedan människans begynnelse som bland annat föda och medicin. Snabbt upptäckte man att vissa växter gav specifika biologiska effekter hos människan vid förtäring och man började använda dessa som medicin av olika slag. Att använda sig av organismer från havet var då relativt ovanligt då havet var svårt att utforska, man ville helst hålla sig över ytan. Dykarklockor uppfanns och senare också dykdräkter. Men det var inte förrän i mitten av 1950 talet som man uppfann föregångaren till dagens dykdräkter. Det var således första gången vi blev relativt oberoende av ytan på grund av medhavda luftgastuber och andningssystem. Denna dykutrustning gjorde det möjligt att ytterligare utvidga området marina organismer som källa för utvecklingen av nya intressanta läkemedelskandidater. (Stonik, 2009) Frågeställningar så som varför inte vissa marina vertebrater är byten för större djur, varför fiskarna inte äter vissa alger och varför inte två svampar växer över varandra gjorde att man hittade intressanta organismer att samla och undersöka. (Newman & Cragg, 2004) I början användes främst metoder där man samlade upp organismer vilka man sedan extraherade fram substanser ur med hjälp av fytokemiska extraktionsmetoder. Eftersom det ofta fanns väldigt små kvantiteter av de biologiskt aktiva sekundära metaboliter i en stor mängd organism fick man snart börja utveckla mer känsliga metoder för att identifiera och utvinna, till exempel NMR, MS/MS och olika kromatografiska metoder.(newman & Cragg, 2004) Substanserna har sedan visat sig vara en mycket intressant källa till nya, spännande sekundära metaboliter med helt nya egenskaper då man sällan hittade substanser som redan var kända. Biokemin från dessa organismer skiljer sig generellt mycket från terrestriala organismers sekundära metaboliter.(stonik, 2009) Det finns många potentiella substanser i pipeline för läkemedelsanvändning idag inom många olika områden såsom onkologi, analgesi, allergi och kognitiva störningar.(newman & Cragg, 2004) En av de stora svårigheterna med att forska kring marina naturprodukter är att de är mycket svårt att hålla dem vid liv och tillåtas växa i en miljö som finns tillgängligt kring ett laboratorium. De lever ofta i mycket extrema miljöer och om man frångår dessa ökar också risken att dess sekundära metaboliter förändrar skepnad och egenskaper.(sarker & Lutfun, 2012) När man väl får tag i en organism är det ofta väldigt små mängder som kan utvinnas i totalt utbyte. Därför är det ofta av intresse att skapa syntetiska eller semi- syntetiska analoger av strukturer där man studerat kärnan i dess biologiska effekt.(sarker & Lutfun, 2012) Dessa analoger ska ha 4

5 ekvivalent eller bättre biologisk aktivitet samt vara lättare och billigare att syntetisera i stora mängder. Steroider Några av de intressanta substanserna som man hittat i marina miljöer är steroider som uppvisar intressanta farmakologiska egenskaper. Contignasterol är en av dessa. (Burgoyne & Andersen, 1992) För att bättre kunna förstå vad det är som gör att contignasterol skiljer sig från andra steroider följer en kortare sammanfattning av vad steroider är och hur de är uppbyggda. Alla steroider är deriverade från triterpen lanosterol och dess strukturer är baserade på ett tetracykliskt ringsystem (Fig 1). Ringarna benämns A- D och kolatomerna numreras med början i ring A. Två ringar i strukturen kan ha antingen trans- eller cisformation. Ringarna A/B har i vanliga mått både cis- och transstrukturer, medan B/C och C/D nästan alltid har transformation. Dubbelbindingar inom molekylen kan också ha trans- eller cisformation.(mcmurry, 2008) Funktionella grupper och protoner som är bundna till ringstrukturen kan vara belägna över eller under ringstrukturen, dessa protoner eller grupper betecknas β och α respektive. De Fig. 1 Schematisk bild av steroiders ringstruktur och de olika ringarnas benämningar.(danielsson & Svensson, 2006) kan också ha en axiell eller horisontell position gentemot ringstrukturen. (McMurry, 2008) I människokroppen är steroider förekommande som hormoner; kemiska signallerare som utsöndras av endokrina körtlar. Dessa härstammar alla från kolesterol som i sin tur syntetiseras från acetylcoenzym A. Mänskliga steroidhormoner är bland annat progesteron, androgen, östrogen, glukokortikoider och mineralkortikoider. (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2007) Steroider används idag mycket inom farmakologin, både som ersättningsterapi och för andra behandlingstillstånd. Både naturliga och syntetiska kortikosteroider används för att minska och dämpa inflammationsreaktioner. Könshormoner så som östrogen och progesteron används som preventivmedel och testosteron som anabola steroider.(mcmurry, 2008) Hur och varför startade forskningen på contignasterol? I slutet av 1980-, början av talet gjordes en stor insamling av marina organismer utanför Papa nya guineas kust. Detta för att samla och screena nya metaboliter från organismer man inte hade så stor kunskap om. En stor målgrupp var att hitta nya cytostatikum, som tidigare gjorts med framgång från marina källor. (Burgoyne & 5

6 Andersen, 1992) Extrakt av svampen Petrosia contignata Thiele, 1899 visade sig innehålla en biologiskt aktiv substans som visade aktivitet i en L1210 cytotoxisk analys.(burgoyne & Andersen, 1992) L1210 är en vanlig cellinje som är välanvänd för att utföra cytotoxiska tester och analyser av cytotoxicitet för olika nya substanser. Denna biologiska aktivitet var det som gjorde att man fann ett tidigt intresse för Petrosia contignata Thiele Med hjälp av 1 H och 13 C NMR metoder gjordes en strukturanalys från extrakt av den aktiva substansen. Man fann att den aktiva metaboliten var en steroid med den mycket ovanliga egenskapen att ha en 14β proton vilket innebär att den har en C/D cisformation i ringstrukturen. Denna molekyl kom att benämnas contignasterol eller IZP (Burgoyne & Andersen, 1992) Vidare absolut konfiguration av contignasterol visade att den hade andra ovanliga egenskaper så som 15- keto, 6- α- hydroxyl och 7- β- hydroxylfunktioner. Det visade sig också att den låg i en långsam jämvikt mellan en hemiacetal och en öppen 22- hydroxy- 29- aldehyd i sin sidokedja(fig. 2). (Yang & Andersen, 2002) Fig 2. Fastställd molekylstruktur av contignasterol efter absolut konfiguration.(yang & Andersen, 2002) Extraktion och isoleringsmetoder Tidig extraktion Det tidigaste arbetet med contignasterol gjordes på biologiskt aktiva extrakt av Petrosia contignata eller som den också kan benämnas; Neopetrosia contignata. Dessa extrakt fick man fram genom att först samla in exemplar av P. contignata för hand och transportera till laboratorierna över torris. Det frusna svampmaterialet täcktes därefter av metanol i rumstemperatur under två dagar. Dekantet av detta extraherades med organiska faser av först hexan och sen kloroform. Efter evaporering av de uppsamlade fraktionerna av kloroform kvarstod en massa som separerades via kromatografi. I det sista reningssteget användes ytterligare en kromatografisk metod följt av HPLC. Utvinningen genom denna metod var 153 mg av 2,5 kg startmaterial. (Burgoyne & Andersen, 1992) 6

7 Syntes av analog Contigasterols komplexa struktur gjorde att man förutspådde dålig farmakokinetisk stabilitet vid vidare utveckling inom det farmaceutiska området. Det faktumet tillsammans med att det var ett väldigt lågt utbyte som kunde utvinnas ur organismen vid extraktion, gjorde det svårt att Fig. 4 Startmolekylen 5- androsten- 3β- ol- 17- one till vänster och den resulterande IPL576,092 till höger efter fullgjord syntes. Syntesen bestod av nio steg och det totala utbytet blev 25%.(Shen & Burgoyne, 2002) Fig. 3 Molekylstrukturerna av contignasterol till vänster och dess syntetiserade analog IPL 576,092 till höger.(shen & Burgoyne, 2002) förutspå en framtid inom farmakologisk läkemedelsanvändning. Men då dess biologiska aktivitet var såpass lovande bestämde sig ett läkemedelsföretag i Kanada, Inflazyme Pharmaceuticals Ltd., att satsa på att göra en syntetisk analog avslöjades den slutliga syntesen som de använde sig av för att skapa IPL576,092 (Fig. 3).(Shen & Burgoyne, 2002) Molekylen är strukturellt mindre komplex än contignasterol och uppvisar en bättre biologiskt aktiv profil. Syntesen startar från 5- androsten- 3β- ol- 17- one och kräver nio steg med ett totalt utbyte på ungefär 25% (Fig. 4). Denna analog skulle senare komma till fas II studier vid kliniska prövningar på människa. (Shen & Burgoyne, 2002) Biologisk aktivitet I sökandet av nya antiinflammatoriska och antiastmatiska substanser vände man sig i början av talet till nya sekundära metaboliter från marina organismer. Substanser från en annan marin steroid, xestobergsterol visade inhibitorisk effekt mot IgE medierade histaminutsläpp och en av substanserna visade även inhibitoriska effekter mot fosfolipas C och IP3. Den mycket liknande strukturen mellan dessa två steroider gjorde att man även började utforska om contignasterol hade antiinflammatoriska egenskaper. (Bramley et al., 1995) Astma Astma är ett tillstånd av reversibel obstruktion och hyperresponsivitet av inhalerade stimuli så som rök och pollen. Detta resulterar i besvär att andas. Den allergiska 7

8 astman är IgE medierad och det akuta svaret vid exponering av allergen är bronkial konstriktion, alltså kontraktion av den glatta muskulaturen kring luftvägarna. Det bildas också en ökad vaskulär permeabilitet vilket leder till ödem. Mastceller spelar en stor roll i regleringsmekanismen för kontraktion av musklerna i luftvägarna. Vid aktivering av receptorer som svarar på IgE antikroppar frisläpper mastcellerna vesiklar med histamin. Histaminet interagerar med den glatta muskelvävnaden som kontraherar. Histaminet initierar också ökad inflammatorisk respons och ökar mukussekretionen i lungorna. (Bramley et al., 1995; "ʺLäkemedelsboken,"ʺ 2014) Den påföljande sena fasen av astma innebär en längre bronkial spasm som är propagerad av mängder med inflammatoriska mediatorer som har infiltrerat vävnaden; cytokiner, kemokiner och adhesionsmolekyler. Detta tillstånd innebär en kronisk inflammation i lungorna med infiltration av olika leukocyter och utsläpp av cytokiner så som TNF- α, IL- 4, IL- 5 och IL- 13. En långvarig kronisk inflammation leder tillslut till vävnadsskador i lungorna och en luftvägshyperresponsivitet. (Kasserra, Harris, Stenton, Abraham, & Langlands, 2004; "ʺLäkemedelsboken,"ʺ 2014) Det finns i stora termer två behandlingsstrategier mot astma. Den ena är en symtomatisk behandling där man vill direkt påverka den bronkiala konstriktionen och relaxera den glatta muskulaturen. Här är till exempel antikolinergika och snabbverkande bronkvidgare vanliga läkemedelsgrupper. Den andra strategin är att påverka den underliggande inflammatoriska patologin, alltså påverka själva orsaken till astman. Olika läkemedelsgruppen som används här är antileukotriener och kortikosteroider. Kortikosteroider ger tyvärr relativt allvarliga biverkningar vid långtidsanvändning. Något som också börjar komma allt mer är specifik immunterapi med monoklonala antikroppar. (Kasserra et al., 2004; "ʺLäkemedelsboken,"ʺ 2014) När forskningen av contignasterol startade fanns ett stort intresse för att hitta substanser att potentiellt använda i läkemedelsutveckling av nya kandidater mot astma.(kasserra et al., 2004) Antiinflammatorisk effekt av contignasterol och dess analog IPL576,092 Resultatet från försök med contignasterol verkade mycket lovande. Contignasterol hade en signifikant inhibitorisk effekt på luftvägarnas inflammatoriska svar vid en exponering av antigen på sensitiserade marsvin både in vivo och in vitro.(bramley et al., 1995) Den inhibitoriska effekten efter en förbehandling av contignasterol tjugo minuter innan exponering var både dos och koncentrationsberoende, vilket är en god antydan på signifikant och korrekt biologisk effekt.(bramley et al., 1995) Effekterna i de första studierna visade på att contignasterol förhindrade bronkiell konstriktion efter antigenexponering. Det fanns också en mer specifik inhibitorisk effekt på 8

9 histaminutsläpp. Denna trodde man kunde bero på en inhibition av histaminutsläpp från mastcellerna, då denna effekt tidigare visats på mastceller hos råttor.(takei, Burgoyne, & Andersen, 1994) Men man visade senare också att topikal administrering av contignasterol förhindrade mikrovaskulär permeabilitet vilket minskar den kemotaxiska infiltrationen av leukocyter och andra inflammationsmediatorer.(coulson & O'ʹDonnell, 2000) Detta är ytterligare en stark faktor till att contignasterol bär på goda antiinflammatoriska egenskaper. På grund av en relativ snabb effekt, full effekt efter en preadministrering tjugo minuter innan exponering, så kan man också utesluta att contignasterol fungerar på samma verksamma sätt som glukokortikoider. Glukokortikoider ökar syntesen av lipocortin som inhiberar fosfolipas A, och att mediera en syntes av ett protein tar längre tid än den tid det tog för contignasterol att uppvisa effekt. (Bramley et al., 1995) Vid jämförelse med en annan substans som redan finns på marknaden som inflammationshämmande preparat; nedocromil under handelsnamnet Tilavist i Sverige, var contignasterol minst lika potent vid skydd mot akut bronkiell kontraktion.(bramley et al., 1995) Det ska tilläggas att nedocromil i skrivande stund i Sverige används mot allergisk conjuktivit. ("ʺFASS,"ʺ 2014) Contignasterols analog IPL576,092 uppvisade ännu starkare inhiberande effekter. I fyra stycken olika djurmodeller; råtta, mus, marsvin och får uppvisade IPL576,092 minskad infiltration av leukocyter i lungvävnaden hos astmamodeller av djuren. Substansen förbättrade lungfunktionen genom att efter preadministrering inhibera den akuta bronkialkonstriktionen och därmed också med stor sannolikhet förbättra den kroniska inflammationen med påföljande hyperresponsivitet. (Kasserra et al., 2004) In vitro studier visade en signifikant reduktion i utsläpp av inflammationsmediatorer såsom TNF- α, PGD2 och IL5.(Shen & Burgoyne, 2002) Mekanismen för substansen är inte helt känd, men den biologiska profilen är skild från glukokortikoiders vilket innebär att man undkommer de bieffekter som långtidsbehandling av glukokortikoider ger. (Kasserra et al., 2004) Läkemedelsutveckling Inflazyme Pharmaceuticals Ltd. var ett kanadensiskt företag som fokuserade på att upptäcka, utveckla och vidare kommersialisera små molekyler till nya antiinflammatoriska läkemedel verkande som astmaläkemedel.("ʺ ) IPL576,092 var ett av deras stora hopp. De skapade också fler analoger av denna som ledde till en serie av 9

10 liknande substanser. Två av dessa kom att avsluta kliniska prövningar fas II studier; IPL576,092 och senare IPL512,602. Inflazyme utvidgade sin verksamhet 2001 genom ett samarbete med Aventis Pharma Inc. i Tyskland där de tillsammans skulle vidareutveckla produkten.(pomager, 2001) Inflazyme avslutade dock samarbetet senare. År 2007 blev Inflazyme uppköpt av det svenska biotekniska företaget Biolipox AB vars majoritet av aktier senare under 2007 blev uppköpta av specialistläkemedelsföretaget Orexo AB.(Orexo.se, 2007) Efter detta finns inga vidare uppgifter om vad som beslutades med IPL576,092 och dess analoger. Ingen information om ytterligare studier går att finna. Orexo kontaktades under denna studie med frågan om vad som hände med IPL- substanserna. Svaret blev att de fick det här projektet på köpet vid köpet av Biolipox och att Orexo aldrig egentligen var intresserade av just detta. Så snart som 2009 såldes det vidare till ett kanadensiskt företag i Vancouver som hade startats av tidigare anställda till Inflazyme; Aquinox Pharmaceuticals. Därefter finns ingen information att hitta om vad som hände med analogerna till contignasterol och tyvärr fanns det inte tid nog under denna studie att kontakta Aquinox Pharmaceuticals. Diskussion Contignasterol var en spännande substans att följa. Det började med att man upptäckte att den hade cytotoxiska egenskaper för att sedan istället satsa på de mer lovande anti- inflammatoriska egenskaper. Contignasterol illustrerar också väl problematiken som fortfarande finns idag med sekundära metaboliter från marina organismer. En komplex struktur och väldigt begränsat utbyte från råmaterial. Det var tyvärr svårt att se hur arbetet fortskred med att hitta farmakoforen för att syntetisera en biologiskt aktiv analog. Mycket av det som man fokuserade på kring contignasterols unika steriodstruktur i början av forskningen blev det mer och mer tyst kring. Vad gäller utvecklingen till läkemedel i de kliniska prövningarna är det också intressant att få insikt i att det beror så mycket på läkemedelsföretagen idag om vad det ska satsas på. Eftersom Orexos största fokus ligger till att utveckla redan befintliga läkemedel baserade på deras egen drug- deliveryteknik kan man spekulera i att en helt ny substans i pipe- line inte var av största intresse för företaget. Men att sedan grundarna och utvecklarna av IPL576,092 inte fortsatt att investera i produkten genom företaget Aquinox Pharmaceuticals beror ju mest troligen på att de inte trodde tillräckligt mycket på produkten. Kliniska prövningar är mycket dyra, och framförallt den största fas III studien. Företaget satsar idag på små 10

11 antiinflammatoriska substanser och ansåg kanske att de hade mer lovande substanser på gång. Men vem vet, kanske ligger det ett projekt och sjuder i bakgrunden? Referenser Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2007). Biochemistry (6th ed.). New York: W. H. Freeman and Company. Bramley, A. M., Langlands, J. M., Jones, A. K., Burgoyne, D. L., Li, Y., Andersen, R. J., & Salari, H. (1995). Effects of IZP (contignasterol) on antigen- induced bronchial responsiveness in ovalbumin- sensitized guinea- pigs. Br J Pharmacol, 115(8), Burgoyne, D. L., & Andersen, R. J. (1992). Contignasterol, a Highly Oxygenated Steroid with the "Unnatural" 14Beta Configuration from the Marine Sponge Petrosia Contignata Thiele, J Org Chem, 57, Coulson, F. R., & O'Donnell, S. R. (2000). The effects of contignasterol (IZP- 94,005) on allergen- induced plasma protein exudation in the tracheobronchial airways of sensitized guinea- pigs in vivo. Inflamm Res, 49(3), Danielsson, B., & Svensson, U. (2006). Organisk- kemisk nomenklatur (3e ed.): Apotekarsocieteten. FASS. (2014). from LIF Kasserra, C. E., Harris, P., Stenton, G. R., Abraham, W., & Langlands, J. M. (2004). IPL576,092, a novel anti- inflammatory compound, inhibits leukocyte infiltration and changes in lung function in response to allergen challenge. Pulm Pharmacol Ther, 17(5), doi: /j.pupt Läkemedelsboken. (2014) (pp. Astma och KOL): Läkemedelsverket. McMurry, J. (2008). Organic chemistry (Vol. 7e). USA: Brooks/Cole Cengange learning. Newman, D. J., & Cragg, G. M. (2004). Marine natural products and related compounds in clinical and advanced preclinical trials. J Nat Prod, 67(8), doi: /np040031y Orexo.se. (2007). Biolipox slutför förvärv från Inflazyme [Press release] Pomager, J. (2001). Inflazyme, Aventis expand collaboration [Press release] Sarker, S. D., & Lutfun, N. (2012). Natural Products Isolation, Methods and Protocols (3rd ed.): Humana Press. Shen, Y., & Burgoyne, D. L. (2002). Efficient synthesis of IPL576,092: a novel anti- asthma agent. J Org Chem, 67(11), Stonik, V. A. (2009). Marine natural products: a way to new drugs. Acta Naturae, 1(2), Takei, M., Burgoyne, D. L., & Andersen, R. J. (1994). Effect of contignasterol on histamine release induced by anti- immunoglobulin E from rat peritoneal mast cells. J Pharm Sci, 83(9), ( ). Yang, L., & Andersen, R. J. (2002). Absolute configuration of the antiinflammatory [correction of antiinflamatory] sponge natural product contignasterol. J Nat Prod, 65(12), doi: /np