Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) by Polymerase Chain Reaction

Transkript

1 Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) by Polymerase Chain Reaction Ashraf Dadgar Supervisor: Karolina Gullsby and Annika Lundbäck KEYWORDS E. coli, eae gene, verocytotoxin, O157:H7, PCR ABSTRACT Escherichia coli is a natural inhabitant of the intestines of both humans and animals, but there are also several pathogenic types of E. coli which cause disease in humans. Strains of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) have been associated with outbreaks of diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome in humans. Most clinical signs of disease arise as a consequence of the production of shigatoxin 1 and 2 or combination of these toxins. Other major virulence factors include EHEC hemolysin and intimin, the product of the eae gene that is involved in attaching and effacing adherence phenotype. EHEC has also been associated with uncomplicated diarrhea. The capacity to control EHEC disease and to limit the scale of outbreaks is dependent upon prompt diagnosis and identification of the source of infection. The principal reservoirs of EHEC are cattle and food products, which presumably have come into contact with domestic animal manure and/or are inadequately pasteurised, these are important vehicles of infection. In the present study, the PCR technique with primers detecting the verocytotoxin genes was shown to be a possible method to screen for and identify EHEC. In summary stx genes were detected in 16 samples of 228 sampels and the eae gene was detected in 2 samples using PCR.

2 INTRODUKTION Escherichia coli är en kort stavformad bakterie som är 1,1-1,5 µm bred och 2-6 µm lång. Den är gramnegativ och i allmänhet rörlig samt fakultativt anaerob. Optimal temperatur för odling av bakterien är 37 ºC. Ett kännetecken som ofta utnyttjas för identifiering av E. coli är bakteriens förmåga att bryta ner många olika sockerarter, såsom laktos, glukos, maltos, xylos, ramnos, arabinos och sorbitol, under syrabildning och ofta gasbildning [1]. Namnet Escherichia har den fått efter Theodor Escherich som isolerade typspecies av genus Escherichia. Escherich publicerade första rapporten om denna bakterie i slutet på 1800-talet. Det stod ganska tidigt klart, att bakterien är normalt förekommande i avföringen hos både människor och djur samt att den också kan orsaka infektioner, såsom urinvägsinfektioner, sepsis, meningit och diarré [1]. Figur 1. E. coli bakterier E. coli kan på serologisk väg delas upp i ett stort antal serotyper. Serotypen är av stor betydelse främst vid diagnostik av de olika grupperna av enteropatogena E. coli. Det finns fyra olika ytantigen-system beskrivna för E. coli: O-antigen, K-antigen H-antigen och F-antigen [1]. O-antigenet utgörs av en värmestabil lipopolysackarid som ofta går under beteckningen endotoxin. Lipopolysackariden har en gemensam lipiddel för samtliga antigen, lipid A, samt en variabel polysackariddel. Lipopolysackaridens lipid A anses ha betydelse för bakteriens biologiska egenskaper såsom förmåga att inducera feber och inflammatoriska reaktioner. K-antigenet, kapselantigenet, är en ren polysackarid. Kapselantigenet är mer värmekänsligt än O-antigenet och har visat sig vara en virulensfaktor. Virulenta E. coli som orsakar parenkymengagerande infektioner har alltid kapselantigen och mer kapselantigen än icke virulenta. Kapseln ökar bl.a. bakteriens förmåga att motstå kroppens försvarsreaktioner, t.ex. fagocytos [1]. H-antigenet eller flagellantigenet är av proteinnatur. Flagellen bidrar till bakteriens rörlighet. F-antigenet, fimbrieantigenet, utgörs av små proteinutskott från bakterien. Fimbrieantigener har betydelse för bakteriens förmåga att fastna på slemhinnor, vilket har visat sig bidra till bakteriens virulens, i synnerhet i fråga om att orsaka urinvägsinfektion [1]. 2

3 E. coli ingår i den normala tarmfloran. Speciellt i tjocktarmen återfinns de i stora mängder. Man återfinner de därför också i perinealområdet och yttre genitalia. E. coli orsakar såväl extraintestinala som intraintestinala infektioner. Som extraintestinala infektioner kan man nämna neonatal meningit, urinvägsinfektion, septikemi och sårinfektion. När det gäller intestinala infektioner är E. coli den vanligaste orsaken till bakteriell diarré över hela världen. Orsaken till att vissa serotyper av E. coli ger upphov till diarré är att dessa E.coli producerar enterotoxin av ett par olika typer: värmelabilt toxin (LT = heat labile toxin), och värmestabilt toxin (ST = heat stable toxin), samt koleraliknande och shigellaliknande toxiner. De enterotoxinbildande kolistammarna är bärare av plasmider som kodar för toxinproduktion. Det finns fyra olika typer av E. coli som kan ge upphov till diarré, enteropatogena E. coli (EPEC), enterotoxigena E. coli (ETEC), enteroinvasiva E. coli (EIEC) och enterohemorragiska E. coli (EHEC) [2]. Enteropatogena E. coli (EPEC) tillhör de klassiska cholera infantum (spädbarnsdiarré) stammarna, som adhererar till tunntarmsepitel. Vissa stammar producerar shigaliknande toxin, vissa värmelabila och värmestabila toxiner som stimulerar mukosaepitelet till kraftigt vätskeläckage. Effekten av detta är voluminösa, vattniga diarréer [2]. ETEC producerar både värmelabilt (LT) och värmestabilt (ST) toxin. LT verkar genom att stimulera produktion av cykliskt AMP i mukosacellerna och ST genom att stimulera guanylatcyklas, vilket resulterar i vattniga diarréer. ST och LT orsakar turistdiarré [3]. EIEC har samma patogena egenskaper och mekanismer som Shigella, dvs. invaderar och förökar sig i enterocyter samt producerar shigatoxin, vilket leder till celldöd med blodiga och variga diarréer, det vill säga dysenteriliknande sjukdom [3]. EHEC orsakar hemorragisk kolit och inte sällan hemolytiskt uremiskt syndrom (HUS). EHEC hittades 1982 av en gastroenterolog i Oregon och Michigan efter tre fall av blodiga diarréer och krampartade magsmärtor utan feber. Sjukdomen är framför allt knuten till E. coli O157:H7, som producerar ett potent cytotoxin, verotoxin, skilt från ST och LT [4]. Figur 2. EHEC O157: H7 3

4 EHEC bakterier betecknas även VTEC (verocytotoxinproducerande E. coli) eller STEC (shigatoxinliknande E. coli). EHEC betraktas ibland som en undergrupp av STEC. Sjukdomsframkallande enterohemorragiska E. coli (EHEC) producerar cytotoxiner som är aktiva på veroceller (celler från vero-apor). Man har hos E. coli hittat två huvudtyper av vero-cytotoxiner, VT1 och VT2, med biologiskt likartad aktivitet. VT1 är identisk med shigatoxinet (Stx) som produceras av Shigella dysenteriae typ 1. Sekvensvarianter finns hos båda typerna, men VT1 är mer konserverad. Eftersom alla dessa toxiner är strukturellt och funktionellt homologa kan de definieras som en familj av shigatoxiner (Stx). De två huvudtyperna betecknas Stx1 och Stx2 och motsvarande gener stx 1 och stx 2 [5]. Toxingenerna är inkorporerade i lambdoida profager i bakterigenomet. En och samma bakterie kan ha mer än en profag och därmed olika kombinationer av stx-gener t.ex. stx 1 + stx 2 eller två stx 2 gener. Toxinproduktionen ligger normalt på en relativt låg nivå. Om profager induceras till lytisk cykel, dvs. fagpartiklar bildas, ökar toxinproduktionen markant. Vid den efterföljande bakteriolysen frigörs toxin samt bakteriofager med stx-genen inkorporerad i fag-genomet. Bakteriofagerna kan infektera och lysogenisera andra tarmbakterier som därmed får förmågan att producera shigatoxin [5]. På en kromosomal patogenicitetsö, LEE, som även finns hos EPEC, finns ett 30-tal gener samlade. Dessa kodar för bl.a. för adhesin (intimin), ett sekretorisk system (typ III) samt ett flertal andra proteiner, t.ex. Tir. Intimin, kodas av eae-genen och är starkt kopplad till serotyper associerade med sjukdom. Det plasmidkodade EHEC-hemolysinet (ehx), som ursprungligen identifierades i E. coli O157:H7, är något mindre kopplat till dessa serotyper. Till skillnad från intimin, som är relativ ovanlig hos nötdjursisolat, återfinns EHEC- hemolysinet frekvent i isolat från nötboskap [5]. E. coli O157:H7 utgör den vanligaste EHEC-serotypen världen över. Men även andra serotyper förekommer. I delar av Europa återfinns en orörlig variant av O157, O157: H, som till skillnad från O157: H7 jäser sorbitol. I kontinentala Europa utgörs 80 % av EHEC isolaten av non-o157 serotyper, varav de vanligaste är O26: H11, O111: H8 och O103: H2. I Sverige är O157: H7 vanligast, men vid perioder utan större utbrott av O157: H7 dominerar non-o157 serotyper [5]. Alla fynd av EHEC skall anmälas av laboratoriet enligt smittskyddslagen, samhällsfarliga sjukdomar, med full patientidentitet [5]. Totalt 95 fall av EHEC O157 rapporterades i Sverige from januari tom augusti 2004 [6]. EHEC koloniserar tjocktarmen och shigatoxinet anses vara den egentliga virulensfaktorn. Stx är ett s.k. 1A + 5B toxin i vilket A-enheten har enzymatisk aktivitet, medan B binder toxinet till receptorn Gb3, som finns på ytan av eukaryota celler. Efter upptag av toxinet translokeras A-subenheten in i cytoplasman där den stänger av proteinsyntesen genom att katalysera nedbrytning av 28S-rRNA varvid cellerna dör. Stx inducerar också signalkaskader som leder till apoptos hos endotel- och epitelceller. Stx kan passera in i blodbanorna och binda till endotelceller i njuren, vilka är rika på Gb3-receptorer. Stx har förmodats orsaka de patologiska förändringar i njuren som är karakteristiska för HUS [5]. I sjukdomsbilden associerad med EHEC varierar symtomen från mild diarré till livshotande HUS. Många patienter drabbas först av vattnig diarré som inom 1-2 dagar kan övergå i blodig diarré och hemmoragisk kolit (HC). Kraftig buksmärta är mycket vanligt. Studier av större utbrott av E. coli O157: H7 visar på att i grova drag 5-10 % av patienterna utvecklar HUS 4

5 med akut njurdysfunktion, hemolytisk anemi och trombocytopeni. Vissa patienter med HUS uppvisar även neurologiska symtom. Små barn och äldre smittas lättast av EHEC [5]. EHEC är känslig för antibiotika som används vid andra tarminfektioner. Trots detta har det varit svårt att påvisa någon klar nytta av antibiotikabehandling, och det verkar inte som om antibiotikabehandling skulle minska risken för utvecklandet av HUS. I de allra flesta fallen går sjukdomen spontant över. Patienten behöver dock intravenös vätsketillförsel under det akuta skedet. HUS kräver sannolikt behandling på intensivvårdsavdelning, inklusive dialysbehandling [7]. För att hitta EHEC-stammar som bildar verotoxin kan man söka efter toxingener, VT 1och VT 2, med så kallad PCR-teknik. PCR står för Polymerase Chain Reaction och en PCR-cykel består av tre olika delmoment. Denna cykel körs normalt sett gånger för att man ska få tillräckligt stor mängd DNA. Mängden DNA ökar exponentiellt i varje cykel och i slutet av PCR-körningen har man fått en mycket större mängd DNA än den man startade med. Figur 3. Beskrivning av en PCR-cykel Denaturering: vid en temperatur på cirka 94 C smälter vätebindningarna i den dubbelsträngade DNA-molekylen och enkelsträngat DNA bildas. Alla enzymreaktioner upphör att fungera på grund av den höga temperaturen. Denatureringen körs under cirka en minut [8]. Annealing: enkelsträngade primers, som tillsätts innan försöket påbörjas, bildar vätebindningar med de enkelsträngade DNA-molekylerna. Annealingen har en arbetstemperatur på ca 54 C och pågår i en minut. Molekylerna bryts och bildas oavbrutet 5

6 beroende på hur stabila de är. När primrarna hittat en komplementär sekvens bildas en stabil bindning. Där fäster polymeraset och börjar kopiera DNA-sekvensen [8]. Extension: denna fas fortgår i cirka två minuter men tiden varieras beroende av den förväntade PCR-produktens längd. Vid ca 72 C arbetar polymeraset som bäst. Endast de primers som bundit exakt med DNA-sekvensen kopieras. Polymeraset som används i PCR kommer från bakterien Thermus aquaticus (Taq). Dess unika egenskap är att den utan problem kan arbeta effektivt i höga temperaturer [8]. Metoden som för närvarande används på enheten för klinisk mikrobiologi i Gävle är artbestämning av sorbitolnegativa kolonier som har vuxit på den selektiva Sorb-Mac plattan med antibiotikasupplement och agglutinering med antisera mot E. coli O157. Med denna metod har man endast möjlighet att identifiera E. coli O157:H7, vilket troligen är den vanligaste serotypen som ger upphov till allvarliga symtom. Med hjälp av PCR kan även andra serotyper av EHEC som har någon av stx-generna identifieras. Syftet med denna studie är att använda PCR-teknik parallellt med odlingsmetoden i utvärderingssyfte på de prover som kommer in med frågeställning EHEC för att se om man kan hitta någon av de andra serotyperna. Efter utvärderingen tas sedan ställning till om EHEC-PCR ska införas som rutinmetod. MATERIAL OCH METOD 228 feacesprover från patienter med frågeställning EHEC var insamlade från 6 mars till 30 september, Proverna odlades på Sorbitol-MacConkey agar (SMAC), innehållande pepton, sorbitol, gallsalter, NaCl, neutralrött, kristallviolet och agar som selekterar för aeroba gramnegativa bakterier. Från primärstryket slammades de utväxta bakterierna i 5 ml sterilt, avjoniserat vatten (eller mindre mängd om bakterieväxten var dålig) till en täthet motsvarande MacFarland 4 (ca x10 9 bakterier/ml). Slamningen kokades varvid bakterierna lyserade och frigjorde sitt DNA-innehåll. De preparerade proverna förvarades i -20 ºC tills PCR-analys utfördes. Som positiv kontroll användes E. coli CCUG som innehöll gener där primers VT 1, VT 2 och eae kunde binda, som negativ kontroll användes E. coli CCUG som saknade dessa gener eller sterilt avjoniserat vatten. Minikriterier för diagnos av EHEC är närvaro av stx 1 och/eller stx 2. Närvaro av eae-genen stärker fyndet av EHEC. De primers som användes var VT1 för målgen stx 1, VT2 för målgen stx 2 och eae för målgen eae (för primersekvens se tabell 1)[9]. Primers köptes från SGS (Scandinavian Gene Synthesis). 6

7 Tabell 1. De olika primersekvenserna samt målgenerna och amplimererna Målgen Primer Primersekvens Amplimer stx 1 VT1 l 5' GAA GAG TCC GTG GGA TTA CG 3' 130 (bp) stx 1 VT1 r 5' AGC GAT GCA GCT ATT AAT AA 3' 130 (bp) stx 2 VT2 l 5' ACC GTT TTT CAG ATT TTA CAC ATA 3' 298 (bp) stx 2 VT2 r 5' TAC ACA GGA GCA GTT TCA GAC AGT 3' 298 (bp) eae eae u 5' CAC ACG AAT AAA CTG ACT AAA ATG 3' 376 (bp) eae eae l 5' AAA AAC GCT GAC CCG CAC CTA AAT 3' 376 (bp) PCR Två olika mixar användes vid PCR-körning. Den första mixen (Mix 1) innehöll primers mot stx 1 och stx 2 -gener och den andra mixen (Mix 2) innehöll primer mot eae-genen. Endast prover som utföll positiva för någon av stx-generna analyserades med Mix 2 som innehöll primers mot eae-genen. Mix 1 innehöll: 33,75 µl sterilt vatten, 5 µl Gen Amp 10 x buffert med Mg 2+ [15 mm], 2 µl dntp [2 µm], 1 µl av primer VT1l [20 µm] för målgenen stx 1 (för primersekvenser se tabell 1), 1 µl av primer VT1 r [20 µm] för målgenen stx 1, 1 µl av primer VT2 l [10 µm] för målgenen stx 2, 1 µl av primer VT2 r [10 µm] för målgenen stx 2, 0,25 µl Taq polymeras [5 U/µl]. Mixens totalvolym var 45 µl vartill 5 µl av de preparerade proverna tillsattes. Mix 2 innehöll: 35,75 µl sterilt vatten, 5 µl Gen Amp 10 x buffert med Mg 2+, 2 µl dntp [2 µm], 1 µl av primer eae l [10 µm] för målgenen eae, 1 µl av primer eae u [10 µm] för målgenen eae, 0,25 µl Taq polymeras [5 U/µl]. Mixens totalvolym var 45 µl vartill 5 µl av de preparerade proverna tillsattes [10]. PCR-rören centrifugerades i rpm i 30 s, innan PCR-körningen startades. Proverna kördes i termocykler (Perkin Elmer 9600, Roche) som påbörjades med denaturering vid 94 ºC i 10 minuter och följdes av 35 cykler av amplifikation med denaturering vid 94 ºC i 20 s, annealing vid 55 ºC i 45 s, extension vid 72 ºC i 10 s och en slutlig extension vid 72 ºC i 10 minuter. Slutligen kyldes proverna till 4 ºC. Körningen tog ca 2 h och 15 minuter. Detektion av PCR-produkter i agarosgel 2,63 g agaros (Sigma) och 150 ml TBE-buffert [0,5 M, ph: 8,2 ] kokades tills gelen hade klarnat. Sedan tillsattes 10 µl etidiumbromid till 0,5 µg/ml. När gelen hade svalnat till 60 ºC hälldes den ut på gelplattan med kammarna i 3:e och 10:e position. 13,5 µl av reaktionsvolymen blandades med 2,5 µl loading buffert och sattes på gelen. Gelelektroforesen (GNA 200) kördes vid 90 V, i 1 h och 30 minuter. Sedan lades gelplattan på UV-ljusbord och kort togs med en polaroidkamera. Analysen påvisade närvaro eller frånvaro av de amplimerer som angivits i tabell 1. 7

8 Resultatanalys Analys av de synliga banden jämfördes med positiv kontroll. PCR kördes om för de svaga banden. PCR-resultaten jämfördes med odlingsresultaten. RESULTAT De totalt 228 preparerade faecesproverna kördes med PCR och PCR-produkterna analyserades med agarosgelelektrofores. Resultatet jämfördes med den nuvarande metoden som är agglutinering av sorbitolnegativa E. coli. Med odlingsmetoden har man endast möjlighet att identifiera EHEC O157:H7. Minikriterier för EHEC är närvaro av stx 1 (130 bp) och/eller stx 2 (298 bp). Närvaro av eae-genen (376 bp) styrker fyndet av EHEC (se figur 3). Figur 3. Stege 0,15-2,1 kbp, stx 1, stx 2, eae-generna. Identifiering av EHEC Alla prover analyserades med primers mot stx-generna. Av de totalt 228 proverna var 16 prover (7 %) positiva för antingen stx 1 eller stx 2. Av de 16 positiva proverna, var 13 positiva för stx 1 (5,7 %) och 3 var positiva för stx 2 (1,3 %). De 16 stx-positiva proverna analyserade med primer mot eae-genen och 2 prover visade sig vara positiva mot eae-genen vilket motsvarar < 1 %. Analysen upprepades tre gånger. DISKUSSION EHEC har de senaste 20 åren orsakat åtskilliga utbrott av magsjuka i världen. Symtomen är svåra magsmärtor och diarréer som kan bli blodiga. Hos upp till 15 % av patienterna utvecklas dessutom hemolytiskt uremiskt syndrom som kan ge bestående njurskador eller i värsta fall ha dödlig utgång. Oftast kommer smittan från nötboskap som smittar människor via felaktigt hanterade, eller opastöriserade, livsmedel [11]. EHEC är farlig eftersom vissa stammar har förmåga att producera verotoxin. Det finns två huvudtyper av verotoxin, VT 1 och VT 2, och bakterien kan producera en eller båda typerna [12]. Andra virulensfaktorer är förmågan att adherera till celler i tarmen, en förmåga som kodas av eae-genen, och förmågan att producera ett hemolysin, vilken beror på närvaro av en stor plasmid. För att begränsa omfattningen av magsjuka orsakad av EHEC är det viktigt med snabb och korrekt diagnos. För att hitta de EHEC-stammar som bildar verotoxin är det mest effektivt att söka efter toxingener med PCR-teknik. 8

9 Syftet med denna studie var att ta ställning till om EHEC-PCR ska införas som rutinmetod eller användas parallellt med odlingsmetoden i utvärderingssyfte på de prover som kommer in med frågeställning EHEC för att se om man hittar några andra serotyper än O157:H7. Denna studie var inte optimal då man inte kunde isolera bakteriestammen. Proverna var heller inte färska utan de var redan preparerade och frysta i -20 ºC. Man skulle ha renat fram DNA först och sedan fryst in de i -70 ºC för mer pålitliga resultat. Med PCR-teknik kunde man hitta 16 prover av 228 som var positiva för stx 1 eller stx 2 och bland de 16 positiva var bara 2 som var positiva för eae-genen (stx 1 + eae). Eftersom VT1 är nästan identiskt med shigatoxinet som produceras av Shigella dysenteriae (det är bara tre nukleotider och en aminosyra som skiljer VT1 från shigatoxin) [13] kan man tyvärr inte med säkerhet säga att de 16 positiva proverna var EHEC, men troligtvis var de EHEC. Däremot kan man med säkerhet identifiera de 2 stx 1 -positiva proverna som även var positiva för eae-genen som EHEC. Med nuvarande odlingsmetod har man endast möjlighet att identifiera EHEC O157:H7. Denna serotyp har distinkta biologiska markörer vilket gör den lätt att känna igen vid odling (se tabell 2) och det har skapat myten att det bara är EHEC av typen O157 som är sjukdomsframkallande, men så är det inte. Alla verotoxinbildande EHEC-bakterier, både av typen O157 och av non-o157, bör identifieras eftersom de kan orsaka blodiga diarréer och hemolytiskt uremiskt syndrom. I synnerhet är det viktigt att hitta bakterien hos barn eftersom de är en speciellt utsatt grupp [14]. Tabell 2. Biokemiska markörer för E. coli O157:H7 Biokemisk test E. coli O157:H7 % positiva Övriga E. coli % positiva ß-Glucuronidas Sorbitol Raffinos Dulcitos Med odlingsmetoden kunde man inte identifiera någon O157:H7 bland de 228 proverna, men med PCR har man troligtvis hittat 2 EHEC-stammar. Eae-genen är inte specifik för O157-stammar utan även non-o157-stammar kan ha eae-genen, och därför kan man inte med säkerhet identifiera de 2 proverna som O157:H7 [15]. I jämförelse med andra laboratoriemetoder för att finna verotoxinbildande EHEC-bakterier är PCR-tekniken betydligt säkrare och dubbelt så många fall kan identifieras [11]. PCR är en snabb, känslig och specifik metod och den bör därför användas vid diagnostisering av EHEC. ACKNOWLEDGEMENT Jag vill tacka mina handledare Karolina Gullsby och Annika Lundbäck för sitt engagemang. Ett speciell tack till Lena Holm som alltid besvarat mina frågor och varit till hands och har hjälpt mig med de praktiska momenten. 9

10 REFERENSER [1] Klinisk Bakteriologi, Arne Forsgren och Göran Kronvall s (1996) [2] Medicinsk Mikrobiologi, Dan Danielsson, 6:e upplagan s (2002) [3] Diagnostic Microbiology, Elmer W. Koneman, Stephan D. Allen, William M. Janda et.al fifth edition s (1997) [4] The Biologic & Clinical basis of infectious diseases, Stanford T. Shuman, John P. Phair, Herbert M. Sommers, fourth edition s. 284 (1992) [5] Referensmetodik för laboratoriediagnostik vid kliniskt mikrobiologiska laboratorier, I. Infektionsdiagnostik, I 1. Infektion i mag-tarmkanalen, Smittskyddsinstitutet 2:e upplagan s (2002) [6] [7] /ksqo157.htm [8] Gene Cloning and DNA analysis An introduction, T.A. Brown, fourth edition s (2001) [9] Stx 1 och Stx 2 åtkomstnummer x07865, eae åtkomstnummer x60439 EMBL DNA-databas [10] Metodbeskrivning för EHEC-PCR, enheten för Klinisk Mikrobiologi, Gävle sjukhus [11] Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC. Microbiological diagnosis, characterisation and clinical bacteriological aspects, Doktorsavhandling av Welinder Olsson Christina (2004) [12]Livsmedelsverketsrapport nr 20 / 2003 [13] Polymerase Chain Reaction for diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli infection and hemolytic uremic syndrome, Michael J. Brian et.al Journal of Clinical Microbiology s , Vol. 30, No. 7, (1992) [14] EHEC - ett livsmedelshygieniskt gissel, Anna-Lena Hegrestad, Svensk veterinär tidning, s , volym 53, nr 12 (2001) [15] Detection in Escherichia coli of the Genes Encoding the Major Virulence Factors, the Genes Defining the O157:H7 Serotype, and Components of the Type 2 Shiga Toxin Family by Multiplex PCR, Gehua Wang et.al Journal of Clinical Microbiology s , Vol. 40, No. 10 (2002) 10

11 11