Optimisation of a method for isolation of Clostridium difficile from. faeces

Transkript

1 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 poäng, Vt-10 Optimisation of a method for isolation of Clostridium difficile from faeces Angelica Nilsson Handledare: Viveca Båverud Statens Veterinärmedicinska Anstalt, Uppsala Enheten för Bakteriologi

2 Abstract Clostridium difficile is a pathogen for both humans and animals and is often associated with antibiotic-associated diarrhea. Recently, several human cases of C. difficile-infection with increased mortality and morbidity have been reported. In studies performed in different countries C. difficile has been found in meat. Therefore the question whether C. difficile can be a zoonotic agent has been raised. The aim of this study was to optimize a method for isolation of C. difficile from faeces. When C. difficile is isolated from animals that do not have diarrhea the sample must be cultivated in an enrichment broth. Parameters influencing the enrichment were tested such as enrichment before and after spore selection, enrichment time, alcohol and heat chock for spore selection and if the samples had to be centrifuged or not before cultivation on agar plates. Enrichment in broth before spore selection was better than after. Heat and alcohol chock showed similar results, therefore you can chose which method you want. Cultivation from the pellet after centrifugation of the sample was better than cultivating directly from the inoculated broth. When the sample had low concentration of bacteria long enrichment time, 7 days or more, was best. The next step will be isolation of C. difficile from food-producing animals and humans and the strains will then be compared to se if the same strain is found in humans and in animals, to se if C. difficile-infection can be a zoonoz. Keywords: Cultivation, enrichment, spore selection, heat chock, alcohol chock 2

3 Introduktion När man första gången upptäckte Clostridium difficile och kunde isolera bakterien gavs den namnet Bacillus diffisilis. Bacillus fick den heta för sin morfologi, och diffisilis för att den var svår att isolera [Keel.M.K, et al., 2006]. Bacillus diffisilis bytte sedan namn till Clostridium difficile på grund av att den är strikt anaerob. Strikt anaeroba bakterier måste ha mindre än 1% syre när de ska växa medan fakultativt anaeroba bakterier kan växa i både syrefri miljö samt miljö med syre i. C. difficile är en anaerob grampositiv stav men den kan bilda sporer när det inte finns tillräckligt med näring eller när den finns i en miljö som inte gynnar tillväxten. Eftersom C. difficile bildar sporer överlever den länge i omgivningen. Vid odling på agarplattor har C. difficile-kolonierna fransig kant, och de hemolyserar inte erytrocyter. C. difficile har en karakteristisk lukt av hästgödsel. C. difficile sporerna dör inte av desinfektionsmedel och hittas därför speciellt i sjukhusmiljö där den framförallt orsakar diarré hos patienter som behandlats med antibiotika [Kuijper.E.J, et al., 2006]. C. difficile förknippades med antibiotika-associerad diarré första gången för cirka 30 år sedan [Bartlett.J.G, et al., 1978]. C. difficile-antibiotika-associerad diarré ses även hos djur [Songer.J.G 2004; Yaeger.M.J, et al., 2007; Rodriguez-Palacios.A, et al., 2007]. Diarrén uppstår när antibiotikan dödar normalfloran vilket gör att balansen i tarmfloran störs och C. difficile-sporerna kan germinera. Germinering innebär att sporer omvandlas från sporer till vegetativa celler. När sporerna har germinerat och inte har konkurrens av normalfloran växer C. difficile till och producerar toxiner som gör att man får diarré [Songer.J.G, et al., 2005]. 3

4 C. difficile producerar framför allt två toxiner, enterotoxin (toxin A) och cytotoxin (toxin B) [Poxton.I.R, et al., 2001]. Enterotoxinet gör så det bildas porer i cellernas membran vilket leder till att cellerna dör. Cytotoxinet gör så celler får ändrat cellskelett och gör bland annat så celler nekrotiseras. Båda toxinerna är skadliga för flera celltyper, de orsakar bland annat ökad vaskulär permeabilitet och inducerar även ett inflammatoriskt svar. I djurförsök har toxin A orsakat omfattande vävnadsskador och vätskeansamlingar i tarmen. Detta gör att man tror att toxin A kan ha en mer kritisk roll än toxin B vid C. difficile-antibiotika-associerad diarré [Bongaerts.G.P, et al., 1994; Poxton.I.R, et al., 2001]. Toxin A kan orsaka stora skador i tarmen utan närvaro av toxin B. Däremot har toxin B, utan närvaro av toxin A, ingen påverkan på tarmcellerna om inte cellerna redan är skadade [G.P.Bongaerts, et al., 1994]. Toxinerna kan diagnostiseras med hjälp av enzyme immunoassay. Enzyme immunoassay använder antikroppar mot toxin A och B för att påvisa om de finns. Med hjälp av PCR kan man påvisa generna för toxin A och B. Flera fall av C. difficile antiobiotika associerad diarré med ökad dödlighet, sjuklighet och återfallsrisk har rapporterats. När man isolerat och typat bakterien från fallen har man upptäckt att de framför allt tillhör ribotyp 027 [Kuijper.E.J,et al., 2006]. Ribotyp 027 har även varit en av de dominerande ribotyper som hittats hos livsmedelsproducerande djur [Rupnik.M 2007]. Ribotyp 027 producerar extra mycket toxin A och B och den producerar även ett binärt toxin. Vad det binära toxinet gör för skada är ännu inte kartlagt [Kuijper.E.J, et al., 2006]. Det som kan skilja de olika ribotyperna åt är vilka toxiner de producerar samt om de har några förändringar i generna för de olika toxinerna. I flera studier som gjorts har man hittat C. difficile i livsmedel [Jöbstl.M, et al., 2010; Rodriguez-Palacios.A, et al., 2007; Von Abercron.S.M.M, et al., 2009; Weese.J.S, et al., 4

5 2010; Weese.J.S, et al., 2009; Von Abercron.S.M.M, et al., 2009]. Man har bland annat hittat C. difficile i kyckling köpt i olika mataffärer i Kanada [Weese.J.S,et al., 2010]. C. difficile har även hittats i köttfärs [Rodriguez-Palacios.A, et al., 2007], nötkött och fläskkött [Weese.J.S,et al., 2009]. I en studie gjord i Österrike undersökte man olika produkter med animaliskt ursprung. I den studien hittade man C. difficile i köttfärs men man kunde inte hitta den i mjölk, således kan mjölk sannolikt uteslutas som smittkälla [Jöbstl.M,et al., 2010]. I Sverige har få studier gjorts angående C. difficile i olika livsmedelsprodukter. I en av studierna som gjorts i Uppsala hittade man C. difficile i kött. Det var dock betydligt lägre andel positiva prover än vad som hittats i andra länder [Von Abercron.S.M.M, et al., 2009]. På grund av att man hittat C. difficile i flera livsmedelsprodukter, framför allt kött, har man börjat undra om C. difficile skulle kunna vara en zoonos som överförs från djur till människor via livsmedel. Zoonos är en infektion som överförs mellan djur och människor. Djuren eller människorna kan vara sjuka när de överför smittan eller så kan de vara bärare utan kliniska symtom. Eftersom C. difficile är svår att odla fram från djur som inte har diarré utan bara är bärare, behöver proverna anrikas för att C. difficile ska kunna isoleras. Man måste även utföra sporselektion, vilket man gör genom etanol- eller värmechock av provet. Vid etanol- och värmechock dödar man andra bakterier samt C. difficiles vegetativa celler. Efter chocken vill man bara ha kvar C. difficile-sporer. Chocken har också den effekten att sporerna lättare germinerar och utvecklas till vegetativa celler. Sporselektion görs för att döda andra bakterier så det blir lättare att detektera C. difficile. Om inte sporselektion görs finns det risk att det växer för många olika sorters bakterier på agarplattan vilket gör det svårt att se förekomst av C. difficile. Det är bara sporer som överlever sporselektion, i normalfloran i tarmen finns det inte så många bakteriearter som är sporformande. 5

6 I detta projekt var syftet att få fram en bra anrikningsmetod för odling av C. difficile från faeces från djur som kan vara bärare av bakterien i låga koncentrationer. I andra studier som gjorts har isoleringen av C. difficile skett på många olika sätt angående anrikningstid, chock före eller efter anrikning, värme- eller etanolchock, centrifugering eller inte före odling på agarplattor med mera [Arroyo.L.G, et al., 2005; Hammitt.M.C, et al., 2007; Jöbstl.M, et al., 2010; Rodriguez-Palacios.A, et al., 2007; Weese.J.S, et al., 2009; Weese.J.S, et al., 2010; Yaeger.M.J, et al., 2007]. Efter att en isoleringsmetod tagits fram ska stammar isoleras. Man ska sedan, med hjälp av molekylära subtypningsmetoder, jämföra olika stammar och se ifall samma stammar finns hos människor som hos livsmedelsproducerande djur. De parametrar som testades i det här projektet var; ska buljongen med anrikat provmaterial centrifugeras och ska utodling av pellet ske eller ska man odla direkt från buljongen? Ska chocken ske före eller efter anrikning i buljongen? Ska etanolchock eller värmechock användas, samt vilka tider för värmechock? Hur lång tid ska proverna anrikas i buljongen? 6

7 Material och metod Provmaterial Tre kolonier av Clostridium difficile stam CCUG 4938 (erhållna från Culture collection, University of Gothenburg) sattes i Fastidious anaerobe broth (FAB) som inkuberades anaerobt (<1% syre; 9-13% koldioxid) 37C i 4 dagar för att få fram C.difficile-sporer som ingick i simulerade provet, beskrivet nedan. För att få med vegetativa celler togs 3 kolonier från agarplatta med C. difficile-stam och blandades med inkuberade buljongen, vilket resulterar i en blandning av sporer och vegetativa celler som används för att spika prover, se nedan. Simulerat prov: Faeces, färsk eller fryst C. difficile-fri faeces från 2 friska mjölkkor, spikades med C. difficile sporer och vegetativa celler, se ovan. Blindtarmsinnehåll från kyckling analyserades när en metod tagits fram. Räkning av bakterier För att veta vilken koncentration av C. difficile man hade i det simulerade provet räknades bakterierna. Stamlösningen var FAB med tillsatta C. difficile sporer och vegetativa celler. Stamlösningen späddes med FAB, varje spädning odlades ut på två Fastidious anaerob agar plattor (FAA) och inkuberades anaerobt 37C i 2 dagar. Efter inkuberingen räknades kolonierna på varje platta och ett medelvärde från de två plattorna för varje spädning räknades ut. Koncentrationen i stamlösningen räknades sedan ut. Odling av prov 7

8 0,11g simulerat prov tillsattes per ml C. difficile buljong med 0,1% taurocholate, 250mg/l D- cykloserin och 8mg/l cefoxitin. Olika parametrar som testades Två chockmetoder för sporselektion av C. difficile testades, etanol- och värmechock. Parametrar som om chocken skulle göras före eller efter anrikning, om man skulle centrifugera och odla pelleten eller odla 10µl direkt från anrikningsbuljongen testades. Olika tider för värmechock testades också. Även olika många dagar för anrikning testades. Anrikningstid 1-8 och 10 dagar innan chock testades. På de prover där olika anrikningstider testades gjordes enbart värmechock efter anrikning och centrifugering med utodling av pellet. Alla tester gjordes i duplikat. Avläsningen innebar att växt av kolonier studerades och jämfördes mellan de olika agarplattorna, och på så sätt se vart det växt mest och vilket alternativ som var bäst. Etanolchock Lika stor volym prov som 96% etanol blandades och inkuberades 60min i rumstemperatur. Direktodling på 10µl av provet gjordes på taurocholat cykloserine cefoxitin fruktos agar platta (TCCFA). Prover centrifugerades även vid 3800g i 10min och bakteriepelleten odlades på TCCFA. Antibiotikan i agarplattan användes för att göra plattan mer selektiv, den hämmar andra bakterier som eventuellt fanns kvar efter sporselektionen. TCCFA-plattorna inkuberades anaerobt 37C i 2 dagar och lästes sedan av. Om etanolchocken gjordes efter anrikning inkuberades proverna 4 dagar först. Om chocken gjordes före anrikning, centrifugerades proverna efter etanolchocken och supernatanten hälldes bort och ny C. difficile buljong tillsattes. Proverna inkuberades sedan anaerobt 37C i 4 dagar varefter odling 8

9 på TCCFA-platta av pellet och 10µl prov gjordes. TCCFA-plattorna inkuberades anaerobt 37C i 2 dagar varefter avläsning gjordes. Värmechock Prover sattes i ett 70C vattenbad och togs upp efter 15min, 30min och 60min. Direktodling på 10µl av provet gjordes på TCCFA-plattor. Prover centrifugerades även 3800g i 10min och pelleten odlades på TCCFA. Plattorna inkuberades anaerobt 37C i 2 dagar varefter avläsning gjordes. Om värmechocken gjordes efter anrikning inkuberades provet 4 dagar först. Om chocken gjordes före anrikning, inkuberades proverna efter värmechocken anaerobt 37C i 4 dagar varefter odling på TCCFA-plattor av pellet eller 10µl prov gjordes. TCCFA-plattorna inkuberades anaerobt 37C i 2 dagar varefter avläsning gjordes. 9

10 Resultat Syftet med arbetet var att få fram en optimal metod för isolering av Clostridium difficile från faeces. Olika parameterar inom metoden testades såsom etanol- och värmechock för sporselektion, olika antal dagar för anrikning, om sporselektionen skulle ske före eller efter anrikning, om proverna skulle centrifugeras eller inte före utodling. Jämförelse etanol- och värmechock samt olika tider för värmechock och centrifugering eller inte före utodling Denna test utfördes i frånvaro av faeces utan bara med FAB med tillsatt C. difficile. Först testades olika tider för värmechock samt jämförelse mellan värmechock och etanolchock. Dessa prover odlades direkt från provet samt centrifugerades. För värmechocken testades inkubering 70C i vattenbad i 15, 30 och 60min. 15 och 30min var likvärdiga medan det växte mindre på de plattor för prover som värmechockades 60min. Etanolchock och värmechock var likvärdiga, chockerna gjordes efter anrikning i 4 dagar. På de prover som centrifugerades före odling på platta växte det mer C. difficile än på de man ej centrifugerade. Efter detta försök valdes 30min ut som tid för värmechock vid fortsatta experiment. Jämförelse etanol/värmechock samt centrifugering eller ej vid utodling av spikade faecesprover Vid detta experiment gjordes ett simulerat prov genom att faeces, som varit fryst, spikades med C. difficile. Etanol- och värmechock gjordes före och efter anrikning, anrikningen var 4 dagar. Proverna jämfördes även avseende centrifugering eller inte före odling på agarplatta. Etanol- och värmechock var likvärdiga även i detta experiment. Centrifugering var bättre även 10

11 i detta experiment. Inför nästa experiment valdes odling direkt från prov bort och alla prover centrifugerades innan odling på agarplattor. Jämförelse etanol/värmechock samt chock före eller efter anrikning för spikade faecesprover Denna gång gjorde man på samma sätt som i föregående experiment fast man centrifugerade alla prov innan utodling. Utodling direkt från provet hoppades över, färsk faeces i stället för fryst användes. Koncentrationen bakterier i faeces var cirka 1,17*10 4 Coloni forming Unit/g faeces(cfu/g faeces). Etanolchock och värmechock var likvärdiga. Chock efter anrikning var bättre än chock före anrikning då det växte mer C. difficile på de plattor där proven hade anrikats innan sporselektion. Chock före anrikning valdes bort inför nästa experiment. Värmechock valdes ut som chockmetod på grund av att den var enklare att utföra. Jämförelse för olika antal anrikningsdagar för spikade faecesprover De olika antal dagar som testades för anrikning var 1, 2, 3, 8 och 10 dagar. Denna gång sänktes koncentrationen bakterier i simulerat prov till cirka 4050 CFU/g faeces. Efter 1, 2 och 3 dagars anrikning växte få kolonier på plattorna; cirka 5, 10 respektive 30 kolonier. Efter 8 och 10 dagars anrikning växte det kolonier över hela plattan. Experimentet gjordes om fast med andra anrikningstider, 4-8 dagar och bakteriekoncentrationen sänktes ytterligare till cirka 2430 CFU/g faeces, för att se hur låg koncentration C. difficile man kan ha i provet och fortfarande kunna detektera dem. Efter 4 och 5 dagars anrikning växte det få kolonier på plattorna. Efter 6, 7 och 8 dagars anrikning hade det växt ungefär lika mycket på plattorna. 11

12 Sammanfattning metod Den färdiga metoden blev att anrikning sker i 7 dagar eller mer varefter sporselektion med värmechock 70C i 30min utförs. Proverna centrifugerades sedan 3800g i 10min följt av odling av pelleten på agarplatta. Agarplattorna inkuberas sedan anaerobt minst 2 dagar varefter avläsning sker. Odling för C. difficile från blindtarm från kyckling Blindtarmsinnehåll från kyckling, cirka 1g sattes i 9ml C. difficile-buljong. Proverna anrikades sedan anaerobt i 37C i 8 dagar. Därefter utfördes värmechock (70C i 30min), centrifugering 3800g i 10min och utodling av pellet på TCCFA-plattor. Plattorna inkuberades anaerobt i 37C och lästes av efter 2 dagar. Kolonier med karakteriskt utseende renodlades på FAA-plattor och sparades därefter i -70C för senare karakterisering. Det odlades blindtarmsprover från 116 kycklingar från 49 olika gårdar. Hos 3 av dessa 116 blindtarmsprover påvisades växt av C. difficile. 12

13 Diskussion Syftet med projektet var att få fram en bra metod att isolera Clostridium difficile från friska djurs faeces där koncentrationen av C. difficile är låg. För att få en överblick över hur andra hade gjort för att isolera C. difficile gjordes en litteraturstudie. Slutsatsen ifrån tidigare studier var att alla hade använt varierande metoder. En begränsning behövde därför göras i projektet angående de olika parametrarna i metoden. I andra studier har olika anrikningsbuljonger använts. Vid val av anrikningsbuljong för denna studie, till vilket proverna skulle tillsättas valdes Clostridium difficile buljong, med 0,1% taurocholate, 250mg/l D-cykloserin och 8mg/l cefoxitin, på grund av att det fanns på substratavdelningen samt hade använts vid tidigare projekt och fungerat bra. Taurocholat tillsätts för att det stimulerar germineringen av sporer till vegetativa celler [Wilson.K.H, 1983]. Cefoxitin och D-cykloserin är antibiotika som tillsätts för att hämma växt av andra bakterier. De flesta bakterier är kännsliga mot Cefocitin och D-cykloserin. C.difficile är resistent mot dessa antibiotika. När tid för anrikning i buljong skulle väljas ut var det svårare för metoderna i tidigare studier hade använt 2 dagar som minst och 15 dagar som längst för anrikning före utodling på agarplatta [Arroyo.L.G, et al., 2005; Jöbstl.M, et al., 2010; Rodriguez-Palacios.A, et al., 2007; Rodriguez-Palacios.A, et al., 2009; Weese.J.S, et al., 2009; Weese.J.S, et al., 2010]. På grund av detta valdes 1-8 och 10 dagar anrikning ut för att testas då låg koncentration C. difficile i prov leder till att det kan behövas längre anrikningstid. Sporerna i provet måste hinna germinera och utvecklas till vegetativa celler och sedan växa tills det blir så hög koncentration av bakterier i buljongen att näringen tar slut så nya sporer utvecklas. Detta gäller om man gör sporselektion efter anrikning. Om man inte inkuberat provet tillräckligt lång tid är risken att det finns så få sporer i provet att det inte är detekterbart. Om man gör 13

14 sporselektion före anrikning måste det finnas tillräckligt med sporer i provet från början och de behöver sedan lång tid på sig att växa till i buljongen. Sporselektion före eller efter anrikning är också något som varierar från studie till studie och ingen har publicerat att de testat vilket som är bäst. Därför valdes detta också ut som en parameter för testning. När sporselektion före eller efter anrikning testades var hypotesen innan att det skulle vara bättre att anrika före sporselektion då det kan finnas låg koncentration av C. difficile i proverna. En nackdel med sporselektion före anrikning är att om det bara finns vegetativa celler i provet så dör de vid sporselektionen. Anrikning före sporselektion visade sig vara bättre, vilket konfirmerar att C. difficile normalt även förekommer som sporform i faeces. Hypotesen angående om centrifugering eller inte av anrikningsbuljongen skulle göras före utodling på agarplatta var att centrifugering skulle vara bättre. Detta visade sig vara sant. Vid centrifugeringen valdes 3800g i 10min för det var vad som använts mest i tidigare studier [Arroyo.L.G, et al., 2005; Jöbstl.M, et al., 2010; Rodriguez-Palacios.A, et al., 2007; Weese.J.S, et al., 2009]. Eftersom det förväntas vara låg koncentration av C. difficile i proverna var hypotesen att lång anrikningstid av provet i buljong behövdes för att kunna detektera C. difficile. Det visade sig att lång anrikningstid var bra. Men när man kom till en viss gräns fick man samma resultat då spelade det ingen roll om man förlängde några dagar. I denna studie var det 7 dagar som var gränsen. Angående värme- och etanolchock som sporselektion fanns ingen hypotes innan om vilket som skulle vara bäst. Här visade det sig att det växte lika mycket C. difficile på plattorna oavsett metod. Således kan man välja vilken metod man vill utifrån vad somär mest praktiskt för laboratoriet. Värmechock valdes i detta fall istället för etanolchock. Värmechock valdes på grund av att den går snabbare att utföra, framförallt för att man inte behöver tillsätta etanol 14

15 och blanda. Om man har många prover tar etanolchock mycket längre tid än värmechock där man bara behöver sätta ner proverna i ett vattenbad. Den slutgiltiga metoden efter våra studier blev anrikning i 7 dagar eller mer. Anrikningen följdes av värmechock, 70C i 30min (man kan även göra etanolchock). Proverna centrifugerades sedan och pelleten odlades ut på TCCFA-platta som inkuberades anaerobt i 2 dagar. Nackdelen med beskriven metoden för isolering av C. difficile är att det är lång anrikningstid. Det finns inga andra metoder för anrikning av C. difficile som är kortare och som visat sig vara bättre. Det är heller inte bråttom med isoleringen av C. difficile i denna studie då djuren inte är sjuka. I denna studie analyserades 116 prover från kycklingblindtarmar. Av dessa växte det C. difficile på 3 plattor. Antalet positiva prover var lågt, 2.6%. Det kan bero på att det används lite antibiotika inom fjäderfäproduktionen i Sverige. När man isolerat C. difficile i köttprodukter i andra länder har man hittat mer C. difficile. I Kanada hittades C. difficile i cirka 20% av prover med köttfärs [Rodriguez-Palacios.A, et al., 2007]. I en annan studie gjord i Kanada hittades C. difficile i cirka 10% av proverna [Weese.J.S, et al., 2009]. De prover som C. difficile detekterades i renodlades och stammarna nedfrystes i 70C för att kunna analyseras vid senare tillfälle. På de stammar som hittats ska multipel-locus variable-numer tandem repeat analysis (MLVA) utföras under MLVA är en molekylär subtypningsmetod. Samtidigt som MLVA utförs på stammar isolerade från djur ska det utföras på stammar som isolerats från människor. Resultaten ska sedan jämföras för att se om det finns samma stammar hos djur som hos människor. Detta gör man för man vill ta reda på om C. difficile kan vara en zoonos och smitta från djur till människa via livsmedel. Gris- och nötprover ska även testas, detta ska göras under

16 Referenser Arroyo.L.G, Rousseau.J, Willey.B.M, et al., (2005), Use of a selective enrichment broth to recover Clostridium difficile from stool swabs stored under different conditions. Journal of Clinical Microbiology (43:10), Bartlett.J.G, Chang.T.W, Gurwith.M, et al., (1978), Antibiotic-associated pseudomembranous colitis due to toxin-producing clostridia. The New England Journal of Medicine (298:10), Bongaerts.G.P, Lyerly.D.M, (1994), Role of toxins A and B in the pathogenesis of Clostridium difficile disease. Microbial Pathogenesis (17:1), Hammitt.M.C, Bueschel.D.M, Keel.M.K, et al., (2007), A possible role for Clostridium difficile in the etiology of calf enteritis. Veterinary Microbiology (127:3-4), Jöbstl.M, Heuberger.S, Indra.A, et al., (2010), Clostridium difficile in raw product of animal origin. International Journal of Food Microbiology (138:1-2), Keel.M.K, Songer.J.G, (2006), The comparative pathology of Clostridium difficile-associated disease. Veterinary Pathology (43:3), Kuijper.E.J, Coignard.B, Tüll.P, (2006). Emergence of Clostridium difficile-associated disease in North America and Europe. Clinical Microbiology and Infection (12:6),

17 Kuijper.E.J, van den Berg.R.J, Debast.S, et al., (2006). Clostridium difficile Ribotype 027, toxinotype III, the Netherlands. Emerging Infectious Disease (12:5), Poxton.I.R, McCoubrey.J, Blair.G, (2001), The pathogenicity of Clostridium difficile. Clinical Microbiology and Infection (7:8), Riley.T.V, Brazier.J.S, Hassan.H, et al., (1987), Comparison of alcohol shock enrichment and selective enrichment for the isolation of Clostridium difficile. Epidemiology and Infection (99:2), Rodriguez-Palacios.A, Reid-Smith.R.J, Staempfli.H.R, et al., (2009), Possible seasonality of Clostridium difficile in retail meat, Canada. Emerging Infectious Disease (15:5), Rodriguez-Palacios.A, Staempfli.H.R, Duffield.T, et al., (2007), Clostridium difficile in retail ground meat, Canada. Emerging Infectious Disease (13:3), Rupnik.M, (2007), Is Clostridium difficile-associated infection a potentially zoonotic and foodborne disease?. Clinical Microbiology and Infection (13:5), Songer.J.G, (2004), The emergence of Clostridium difficile as a pathogen of food animals. Animal Health Research Reviews (5:2), Songer.J.G, Anderson.M.A, (2005), Clostridium difficile: An important pathogen of food animals. Anaerobe (12:1),

18 Von Abercron.S.M.M, Karlsson.F, Wigh.G.T, et al., (2009), Low occurrence of Clostridium difficile in retail ground meat in Sweden. Journal of Food Protection (70:8), Weese.J.S, Avery.B.P, Rousseau.J, et al., (2009), Detection and enumeration of Clostridium difficile spores in retail beef and pork. Applied and Environmental Microbiology (75:15), Weese.J.S, Reid-Smith.R.J, Avery.B.P, (2010), Detection and characterization of Clostridium difficile in retail chicken. Letters in Applied Microbiology (50:4), Wilson.K.H, (1983), Efficiency of various bile salt preparations for stimulation of Clostridium difficile spore germination. Journal of Clinical Microbiology (18:4), Yaeger.M.J, Kinyon.J.M, Songer.J.G, (2007), A prospective, case control study evaluating the association between Clostridium difficile toxins in the colon of neonatal swine and gross and microscopic lesions. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation (1:19),