CRYOPRESERVATION OF OOCYTES Comparison between the Cryoloop and the Cryopette vitrification techniques

Transkript

1 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi EXAMENSARBETE Biomedicinska analytikerprogrammet Fortsättningskurs D, Vt 2010 CRYOPRESERVATION OF OOCYTES Comparison between the Cryoloop and the Cryopette vitrification techniques Sara Ekberg Handledare: Julius Hreinsson Praktisk handledare: Fatma Gülen Yaldir Reproduktionscentrum, Akademiska sjukhuset 1

2 ABSTRACT Crypreservation of oocytes is recently being considered to be a valid choice in infertility treatments. Low survival and fertilization rates due to inefficient slow freeze protocols have been the outcome of many previous studies done in the field. However, introduction of the vitrification technique and its application in reproductive medicine and to some extent new improved slow freeze protocols have shown that oocytes can be cryopreserved with successful outcome. In this project the survival rate of oocytes after vitrification with MediCult Vitrification and Warming Media has been studied. Also, a comparison of the carriers Cryoloop (an open system) and Cryopette (a closed system) has been performed. A total of 43 oocytes were vitrified and warmed according to MediCult's protocol, of which 21 oocytes with Cryoloop and 22 with Cryopette. The cells were post-thaw incubated in a physiological environment for 24h. During that time the morphology and viability were observed and noted after 2h, over night and after 24h. No significant difference in survival rates of the oocytes' was observed using the two carriers, and the total survival rate of the oocytes was 83.7%. This indicates that cryopreservation of oocytes is a valid choice in fertility treatments and that the new product Cryopette can be used clinically with just as good results as the well established Cryoloop technique. This merits further studies on the applicability of vitrification on oocytes and the Cryopette technique. Keywords: Oocytes, cryopreservation, vitrification, Cryoloop, Cryopette 2

3 SAMMANFATTNING Frysförvaring av spermier och embryon är idag vedertagna tekniker som används regelbundet på fertilitetskliniker runt om i världen med goda resultat. När det kommer till äggceller har utfallet varit sämre. Äggceller har länge ansetts vara svåra att frysa då de är känsligare än embryon. Konventionella frysmetoder har inte gett tillräckligt bra resultat för att äggfrysning ska kunna tillämpas annat än i forskningssyfte eller undantagsfall. Men med introduktionen av en ny metod vitrifiering - har bättre resultat gällande överlevnad och befruktning kunnat presenterats i ett flertal studier. I detta projekt har överlevnaden hos äggceller efter vitrifiering undersökts samt en jämförelse mellan två vitrifieringstekniker, Cryoloop och Cryopette utförts. Totalt 43 äggceller vitrifierades antingen med Cryoloop (21 ägg) eller Cryopette (22 ägg). Äggcellerna förvarades i flytande kväve (- 196C) under minst 48h innan de tinades och bedömdes. Av de 43 äggcellerna överlevde 83,7% vilket anses vara ett bra resultat. I jämförelsen mellan de två teknikerna visade denna studien ingen signifikant skillnad vilket kan tyda på att teknikerna är jämbördiga vilket leder till att fler och mer omfattande studier bör göras för att med säkerhet fastställa detta. 3

4 INTRODUKTION Det finns idag, i och med att tekniken hela tiden utvecklas och en öppnare syn på fertilitetsbehandlingar och provrörsbarn har växt fram, flera olika möjligheter för individer med nedsatt fertilitet att bli föräldrar utan att adoptera. Idag erbjuds förutom in vitro-fertilisering och inseminering med parets egna könsceller även fertilitetsbehandlingar med donerade könsceller både från kvinnliga och manliga donatorer. Embryodonation och surrogatmoderskap är däremot inte lagligt i Sverige även om diskussioner om ändring i lagstiftningen pågår. Det är främst på grund av etiska skäl som dessa typer av behandlingar inte är tillåtna. Behovet av långtidsförvaring av könsceller har ökat successivt ända sedan frysförvaring började användas kliniskt. Förutom frysförvaring av embryon så sparas könsceller som en fertilitetsbevarande åtgärd inför behandling mot cancer och autoimmuna sjukdomar. Behandling med cytostatika och strålning kan orsaka irreversibla skador på könscellerna, dessutom förekommer invasiv cancerbehandling där äggstockar eller testiklar och därmed könscellerna avlägsnas helt. Därför försöker man att tillvarata könsceller innan behandlingen påbörjas för att sedan förvara dem tills patienten i fråga är friskförklarad [1]. Även frysförvaring av donerade könsceller förekommer. Främst är det spermier från donatorer som frysförvaras då de är lättåtkomliga vid provtagning samt har frysts ned kliniskt med gott resultat de senaste trettio åren. Nedfrysning av donerade oocyter förekommer också i klinisk verksamhet men i än så länge ganska låg utsträckning, de flesta ET 1 som utförs med donerade äggceller görs med färska ägg. Vid IVF-behandlingar är det önskvärt att ha ett flertal oocyter att befrukta för att öka chanserna för en graviditet. Med hormonbehandling triggas fler ägg att mogna ut än vid en naturlig menstruationscykel, 1 ET Embryo transfer. Befruktat embryo återförs i livmodern via kateter. 4

5 stimuleringen behövs även för att styra cykeln så att embryot befruktas och återförs i rätt fas för att en möjliggöra en graviditet. Den naturliga menstruationscykeln är indelad i två faser, follikelfasen och lutealfasen, vilka skiljs åt av ägglossningen. Under follikelfasen utsöndras FSH från hypofysen vilket leder till att ett antal äggblåsor börjar mogna i ovariet. FSH stimulerar även bildandet av LH-receptorer i äggblåsorna. De aktiverade äggblåsorna börjar att utsöndra estradiol vilket i sin tur påverkar LH-sekretionen så att den ökar. LH stimulerar proliferation av äggblåsorna så att de börjar utvecklas till mogna oocyter. När LH når sin maximala nivå (LH-toppen) startas ägglossningen, då kommer en utav de oocyterna som påbörjat mognad att utsöndras medan de övriga avstannar i mognaden och istället tillbakabildas. Vid hormonstimulering tillförs hormoner utifrån för att starta upp och styra menstruationscykeln så att ett större antal äggblåsor börjar utvecklas och ingen tillbakabildning av äggblåsorna sker. Detta behövs för att få ut ett så stort antal oocyter som möjligt vid OPU 2 och därmed öka chanserna till befruktning in vitro. Oocyter observeras i tre olika mognadsstadier GV 3, MI 4 och MII 5 (figur 2a-c), dessa stadier bestäms visuellt via ett mikroskop. I GV-stadiet befinner sig oocyten i profas i den första meiosdelningen och har varit det under hela follikelutvecklingen. Kärnan syns tydligt i ett mikroskop och brukar liknas vid ett öga. Oocyter i GV-stadiet kan inte bli befruktade då de inte genomgått de meiosdelningar som krävs och innehåller för mycket genetiskt material. 2 Ovarian Pick Up kirurgisk aspiration av äggceller ur ovariets äggblåsor. 3 Germinal vesikel oocyten första mognadsstadium 4 Metafas I oocytens andra mognadsstadium 5 Metafas II mogen oocyt som kan bli befruktad 5

6 Nästa mognadsgrad är MI-stadiet. Oocyten har då gått över till metafas i den första meiosdelningen. Kärnmembranet har lösts upp och kromosomerna ligger uppradade på spoltrådar. Visuellt känns MI-oocyter igen via sin släta yta och brist på germinalvesikel och polkropp. Inte heller i MI-fasen kan oocyten befruktas. Det sista mognadsstadiet för en oocyt är MII-stadiet. Cellen befinner sig i metafas i den andra meiosdelningen och kan inte vidareutvecklas utan befruktning. Det extra genetiska materialet som finns i tidigare stadier har utsöndras i en polkropp. Det är även polkroppen som skiljer MII-oocyter från MIägg vid visuell bedömning. När oocyten befruktas bildas en zygot och meiosen sluförs. Tecknet på befruktning är att två pronuclei kan observeras, även den andra polkroppen blir synlig. Zygoten fortsätter att dela sig och bildar efter ett dygn ett pre-embryo med två celler, efter två dygn fyra celler och efter tre dygn åtta celler. På dag fyra kallas zygoten för morula och består av minst nio celler och fem dagar efter befruktningen har en blastocyst bildats. Blastocysten känns igen genom ett yttre cellager av trofoblaster samt att den inre cellmassan ligger orienterad mot ena cellväggen det här även uppstått ett hålrum inuti blastocysten. För att en cell ska kunna överleva nedfrysning måste den först behandlas med kryoprotektaner. Dessa lösningar är ofta toxiska i höga doser och brukar indelas i permeabla eller icke-permeabla [2]. Till de permeabla kryoprotektanterna hör DMSO 6, propandiol och etylenglykol, två välanvända men toxiska ämnen som stabiliserar cellen inifrån och bevarar den inre cellstrukturen. Vitrifieringslösningar brukar även innehålla sukros, som är en icke-permeabel kryoprotektant som via osmos driver ut vattnet i cellen och därmed minskar risken för att skadliga iskristaller bildas inuti den. Då cellen minskar en del 6 DMSO - Dimetylsulfoxid 6

7 av sin storlek efter det osmotiska utbytet minskar behovet av höga koncentrationer permeabla kryoprotektanter. Därför anses det att förekomst av sukros sänker toxiciteten i vitrifieringslösningar då risken att cellen skadas av de toxiska kryoprotektanterna ökar med ökande koncentration och exponeringstid. Därför pågår ett forskningsarbete för att ta fram frysprotokoll med så låg koncentration och exponeringstid av kryoprotektanter som möjligt. I dagsläget är det främst spermier och embryon som frysförvaras i samband med donationsprogram och fertilitetsbehandlingar. Oocyter har tidigare ansetts vara svåra att förvara då överlevnad och fertilisering efter frysning har varit låg i ett flertal studier [3 5]. Bland annat så publicerade Tucker et al.[3] 1998 resultat från studier där överlevnaden hos nedfrysta och tinade oocyter var 55%. De undersökte även fertiliseringsgraden och av 45 tinade ägg var det endast 1 som ledde fram till en avslutad graviditet. I samma artikel beskrevs även skillnaden i överlevnad mellan mogna MII-oocyter och omogna GV-oocyter. Av de mogna äggen var det 2.2% av de som frysts ned som överlevde medan 44% av de omogna oocyterna överlevde. MII-oocyter har sina kromosomer uppradade på kärnspolen och inte skyddade i kärnan vilket gör dem mer utsatta än GV-äggen [6]. Det finns dock andra studier [7,8] som föreslår att GV-ägg skulle vara känsligare för nedfrysning. Orsaken till detta tros vara att cellerna har ett skörare cellmembran i det här stadiet och att även om de har en högre överlevnadsgrad än MII-oocyterna så kan de förlora sin förmåga att mogna ut och därmed bli fertiliserade. Ovanstående studier har genomförts med metoden slow-freeze, en väletablerade metod som används kliniskt vid frysförvaring av embryon i det flesta länder. Det har dock på senare tid forskats mycket på en annan metod, vitrifiering, som enligt många kan vara lösningen på problemet med låg överlevnadsgrad hos nedfrysta oocyter. 7

8 Den första lyckade nedfrysningen av embryon gjordes 1972 av Whittingham et al [9]. Det är det försök som ligger till grund för det konventionella slow-freezeprotokollet som används idag. Försöket gjordes på musembryon som har en hel del likheter med humana embryon, men det dröjde dock fram till 1983 innan det första barnet föddes efter en human embryonedfrysning [10]. När man frysbevarar oocyter med ett slow-freezeprotokoll prepareras äggen med låga koncentrationer av kryoprotektant och laddas därefter i en hållare, vilken långsamt kyls ned till -6C. Vid -6C induceras bildandet av iskristaller manuellt i lösningen, så kallad seedning. Efter seedning kyls hållaren ned till -196C i vilken temperatur ägget sedan förvaras. Ett slow-freezeprotokoll tar cirka 2 timmar vilket medför att oocyten utsätts för en lång exponering av kryoprotektanter även om det sker vid en låg koncentration. Detta anses vara en orsak till att slow-freeze inte gett så goda resultat för oocyter. På senare tid har dock bättre protokoll tagits fram bland annat med Na-fria lösningar vilka genererat betydligt bättre resultat än tidigare protokoll [11]. Redan på slutet av 1800-talet presenterades den första teorin om vitrifiering. Det var dock inte för än Basile J Luyet började förbättra metoden under 1930-talet som den på allvar blev riktigt uppmärksammad. Men på grund av svårigheterna med att kyla ned cellerna tillräckligt snabbt och samtidigt skydda dem mot frysskador lyckades han inte överföra teorin i praktiken. Trots att fler forskargrupper arbetade med vitrifiering dröjde det ända fram till 1985 innan Rall och Fahy fastställde ett såpass bra protokoll för vitrifiering att metoden kunde börja användas praktiskt. De lyckades med att frysa ned och tina upp 8-celliga musembryon utan degenerering [12]. Sedan dess har tekniken fortsatt att utvecklas. Vid vitrifiering doppas cellen direkt ned i flytande kväve efter behandling med kryoprotektanter och vitrifieringslösning. Vitrifieringslösningen bildar vid kontakten med kvävet en glasliknande 8

9 struktur i vilken cellen kapslas in. Med vitrifering frångår man helt bildandet av iskristaller vilka kan skada cellen, det behövs dock höga halter kryoprotektant för att skydda cellen mot den mycket snabba nedkylningen. Trots detta är överlevnaden och fertiliseringsgraden hos oocyter som vitrifierats dokumenterat bättre än hos dem som frysts med slow-freeze [13, 14]. Anledningen till detta beror troligtvis på den korta exponeringstiden i lösningen innan nedfrysningen. Efter att oocyterna frysts ned så förvaras de i tankar fyllda med flytande kväve. Kväve är flytande vid -196C, en temperatur där ingen biologisk aktivitet är möjlig. Cellen kommer därför att befinna sig i dvalliknande tillstånd och därmed inte åldras eller genomgå cellförändringar. Den enda risken för skador medan cellen är i förvaring anses vara från bakgrundsstrålning [1]. En annan risk med frysförvaring anses vara smittspridning i kvävet [15]. Mikroorganismer som kan överleva i extremt kalla miljöer har en teoretisk möjlighet att spridas mellan celler som förvaras öppet i kvävet. Även om den risken anses vara mycket liten så arbetas det med att ta fram slutna förvaringssystem där cellerna är helt isolerade från kvävet. När oocyten genomgår ett frys- och tiningsprotokoll utsätts den för flera typer av stress; mekanisk vid själva handhavandet av cellen, kemisk vid prepareringen med frys- och tiningslösningar och termisk vid nedkylning och uppvärmning. Detta kan orsaka ett flertal patologiska tillstånd hos cellen och till och med få den att degenerera. Hos oocyter i MII-stadiet har det bildats tubulintrådar (även kallat spoltrådar) mellan kärnspolarna. På dessa finns kromosomerna uppradade inför delning. Detta komplex är känsligt för temperaturförändringar, vilka orskar de- och repolymerisation av spoltrådarna. Vid temperaturer lägre än 35C depolymeriseras spoltrådarna och nedkylning till rumstemperatur (20C) kan vara skadligt för 9

10 oocyterna vilket Pickering et al. publicerad data om 1990 [16]. Repolymerisering sker efter inkubering i fysiologisk miljö. Det är dock debatterat om repolymerisationen sker korrekt och misstankar om aneuploidi och andra kromosomavvikelser finns sammankopplade med frysförvaring av oocyter. Senare studier har dock påvisat att cellen är förmögen att återbilda spoltrådarna korrekt [2, 17] och en studie pekar även på att oocyter frysta efter vitrifieringsprotokoll återhämtar sig snabbare än de frysta med slow-freezemetoden [17]. Skador på zona pellucida (oocytens yttersta skal) så som frakturer och förtätning av zonan är förenat med kryoförvaring av oocyter. Förtätning av zonan påverkar fertiliseringen då spermier inte kan penetrera zonan och därmed ta sig in i oocyten. Problemet har dock kringåtts genom att de oocyter som tinats alltid befruktas genom ICSI 7 [17]. Förutom de tillstånd som tagits upp ovan kan det ha uppkommit skador på DNA vid behandlingen. Dessa syns inte vid undersökning i mikroskop men kan påverka fertilisering eller utveckling av embryot [18]. Målen med projektet var att jämföra två olika metoder vid vitrifiering av obefruktade oocyter i olika mognadsstadier samt att undersöka viabiliteten hos obefruktade oocyter efter vitrifiering. De två metoder som jämfördes var Cryoloop från Vitrolife ett öppet och väletablerat system som används kliniskt på många IVF-laboratorier och Cryopette från Medicult ett helt nytt slutet system som ej ännu lanserats på marknaden. Detta utfördes delvis för att evaluera en för laboratoriet ny metod med nytt material (Cryopette), samt för att undersöka viabiliteten för oocyter efter vitrifiering. 7 Intracytoplasmisk injektion direktinjektion av spermie i oocytens cytoplasma 10

11 MATERIAL OCH METOD Oocyter Etiktillstånd för forskning om vitrifiering av oocyter har utfärdats till Reproduktionscentrum. Alla oocyter som användes i projektet kommer från patienter på Reproduktionscentrum, Akademiska sjukhuset. Oocyterna som användes i projektet var antingen omogna eller bedömda som ej befruktningsdugliga och skulle kasseras då de exkluderats ur patientens behandling. Innan oocyterna togs med i projektet denuderades de av embryolog på Reproduktionscentrum. Vid denudering avlägsnas de stödceller som normalt omger oocyten enzymatiskt, med hyaluronidas och mekaniskt genom att oocyten pipetteras upprepade gånger tills stödjecellerna släppt från oocyten. Då stödjecellerna avlägsnats bedömde en embryolog äggets mognadsgrad som GV, MI eller MII (figur 1a-c) samt morfologin. De oocyter som inte var befruktningsdugliga flyttades från den kliniska verksamheten till projektet, efter att de avkodats från patientuppgifter. När oocyterna använts i projektet kasserades de. Figur 1a: GV-oocyt, med synlig germinal vesikel. Bild: Svend Lindenberg Figur 1b: MI-oocyt, ingen synlig vesikel eller polkropp. Bild: Sara Ekberg Figur 1c: MII-oocyt med en tydlig polkropp. Bild: Standford Hospital and Clinics 11

12 Cryoloop Cryoloop (figur 2) tillverkas av Vitrolife och består av en 20 µm tjock nylontråd formad till en loop med en diameter på mm. Tråden är monterad på en hållare som i sin tur sitter i locket på ett cryorör. Vid vitrifering 'coatades' loopen med vitrifieringslösning och oocyten applicerades på ytan av loopen med en pipett. Då vitrifieringslösningen är mycket viskös hölls oocyten fast i loopen med hjälp av ytspänning. Cryoloop är ett öppet system och loopen doppades direkt ned i flytande kväve vid vitrifieringen. Cryoröret tillhörande Cryoloopen sänktes därefter ned i kvävet och locket med loopen skruvades fast i röret. Figur 2: Cryoloop från Vitrolife laddad med två oocyter. Bild: Fertlitetscentrum Cryopette Cryopette (figur 3) är ett nytt system vid vitrifiering av oocyter och embryon. Systemet är helt slutet så att oocyten aldrig kommer i direkt kontakt med kvävet. Cryopette är en pipett med en inre diameter på 275µm och en längd på 23,7mm, vilket gör att den suger upp exakt 1,2µl, en optimal mängd vitrifieringsmedium vid långtidsförvaring av oocyter. Äggcellen sugs upp i cryopetten från vitrifieringslösningen och förseglas genom att spetsen av pipetten smältes samman. Cryopetten doppas därefter direkt ned i flytande kväve där den sedan förvaras. 12

13 Vitrifiering av oocyter Figur 3: Cryopette från MediCult. Bild: MediCult Vitrifieringsmediet som användes var Vitrification Cooling, product No.1218 (MediCult). Produkten utgörs av två lösningar; 'equilibration medium' och 'vitrification medium'. Produkten innehåller etylenglykol och 1,2-propandiol, vilka fungerar som kryoprotektanter. I vitrfication medium finns det utöver detta sukros. I övrigt består produkten av små mängder plasmaprotein, natriumklorid, L- glutamin, natriumlaktat, natriumbikarbonat, kaliumklorid, kalciumklorid, kaliumfosfat, magnesiumfosfat och natriumpyruvat. I lösningarna finns det även antibiotika i form av penicillin och streptomycin. Inga koncentrationer på beståndsdelarna kan anges då dessa är konfidentiella och endast kända av tillverkaren. 500 µl av de båda lösningarna pipetterades ned i en fyrbrunnsskål och värmdes till rumstemperatur under 30 minuter. De oocyter som skulle vitrifieras i en hållare placerades i 'equilibration medium' under i 5 minuter och flyttades sedan till vitrification medium. Oocyterna monterades i hållaren med 'vitrification medium' inom 1 minut från nedläggning i mediet. Hållaren doppades därefter direkt ned i flytande kvävet där den sedan förvarades. Tid och temperatur för 'Vitrification Cooling' finns redovisat i tabell 1. Tabell 1: Tid och temperatur för Vitrification Cooling Lösning Temperatur Exponeringstid för oocyt i lösning Equilibration medium Rumstemperatur (~ 20C) 5 minuter Vitrification medium Rumstemperatur (~ 20C) 1 minut 13

14 Uppvärmning av oocyter Vid uppvärmning av frysta oocyter användes produkten MediCult 'Vitrification Warming' Product No Kitet innehåller 5 lösningar; 'Warming medium', 2 'dilution medium', 2 'washing medium'. 'Warming medium' och 'dilution medium' innehåller sukros vilket behövs för att oocyten skall kunna utjämna vätskebalansen som rubbats av vitrifieringslösningen på ett säkert sätt. Sukros minskar risken för att cellen sväller för mycket vid rehydreringen när kryoprotektanterna tagits bort.'washing solution' innehåller dock inte sukros då cellen utjämnat vätskebalansen klart när den placeras i 'washing medium'. Utöver dessa kompontenter ingår det små mängder glukos, natriumklorid, L-glutamin, natriumlaktat, natriumbikarbonat, kaliumklorid, kalciumklorid, kaliumfosfat, magnesiumfosfat och natriumpyruvat. Det ingår även antibiotika i form av pencillin och streptomycin för att motverka bakterieväxt. Inga koncentrationer på beståndsdelarna kan anges då dessa är konfidentiella och endast kända av tillverkaren 'Warming medium' värmdes till 37C under 30 minuter, resterande 4 lösningar värmdes till rumstemperatur under 30 minuter. Vid upptining av oocyter vitrifierade i cryoloop flyttades loopen till lösningen 1 direkt från det flytande kvävet. Oocyter vitrifierade i cryopette värmdes genom att cryopetten sänktes i 37C vatten i 5 sekunder innan de pipetterades i lösning 1. Oocyterna fick ligga i vardera lösning (1-5) under 3 minuter innan de flyttades till odlingsmedium. Tid och temperatur för 'Vitrification Warming' finns redovisade i tabell 2. 14

15 Tabell 2: Tid och temperatur för Vitrification Warming Lösning Temperatur Exponeringstid för oocyt i lösningen Warming medium 37C 3 minuter Dilution medium Rumstemperatur (~ 20C) 3 minuter Dilution medium Rumstemperatur (~ 20C) 3 minuter Washing medium Rumstemperatur (~ 20C) 3 minuter Washing medium Rumstemperatur (~ 20C) 3 minuter Odling och bedömning Oocyterna odlades i odlingsmediet G-IVF Plus, produktnr:10136,vitrolife. I botten av en petriskål placerades odlingsmedium i droppar om 20µl. Dessa täcktes med mineralolja (i det här fallet Ovoil, produktnr: 10029, Vitrolife) och preinkuberades mellan 4 och 24h i fysiologisk miljö - 37C med en gasmättnad på 6.0% CO 2 och 6.0% O 2 innan oocyterna placerades i mediet. Preinkuberingen behövs för att odlingsmediet ska anta rätt temperatur och gasmättnad så att oocyterna placeras i en så perfekt miljö som möjligt. Vid tre tidpunkter (efter 2h, efter natt och efter 24h) plockades oocyterna ur inkubatorn och morfologi och viabilitet (figur 1a-c) bedömdes visuellt via ett mikroskop efter förutbestämda kriterier (tabell 3). Exempel på oocyter med nedsatt kvalitet kan observeras i figur 4a-c. Den sista tidpunkten (24h) var vid den som det lades mest vikt vid och är dessutom den tidpunkt som redovisas i resultaten. Tabell 3: Kriterier vid bedömning av viabilitet och morfologi hos oocyter Bra kvalitet Nedsatt kvalitet Form Regelbunden, rund Oregelbunden, kantig Cytoplasma Ljus Mörk Slätt utseende Granulerad Inga vakuoler Vakuoler Zona pellucida Intakt Bruten, hängande Polkropp (MII-oocyter) Endast 1 Fler än 1 15

16 Figur 4a: Granulerad MIIoocyt. Granulering känns igen på den korniga cytoplasman. Figur 4b: Vakuoliserad MIoocyt. Figur 4c: Degenererad oocyt med ovanligt tjock zona pellucida. Statistik Efter att alla resultat samlats in jämfördes värdena med Fishers exakta test. Detta för att påvisa eventuella signifikanta skillnader mellan de olika grupperna. RESULTAT Överlevnad och fryspåverkan I detta projekt vitrifierades totalt 43 oocyter, som delades in i två grupper Cryoloop och Cryopette. Inga oocyter gick förlorade under arbetet utan alla oocyter som vitrifierades återfanns efter tiningen. Hur oocyterna i vardera grupp klarade av processen finns redovisat i ett flödesschema (figur 5). Med viabla oocyter menas alla de oocyter som ej visade tecken på degenerering. Det finns dock oocyter i den här gruppen som visade tecken på nedsatt kvalitet efter tining och inte skulle ha befruktats i klinisk verksamhet. Dessa oocyter återfinns under rubriken fryspåverkade i flödesschemat och består till största del av oocyter som blivit vakuoliserade under processen, men även oocyter med mycket granulering eller mörk cytoplasma har observerats. 16

17 Hur överlevnad och fryspåverkan förhåller sig mellan Cryoloop och Cryopette i de olika mognadsstadierna kan observeras i figur 6. Signifikansen mellan de olika grupperna testades mot varandra i Fishers exakta test. Ingen signifikant skillnad påvisades mellan grupperna. Vidareutveckling De oocyter som vidareutvecklats kan observeras i figur 7. Det är endast GV- och MI-ägg som är redovisade då MII-oocyter redan har utvecklats så långt de kan utan befruktning. Totalt antal oocyter 43 Vitrifierade i Cryopette 22 Vitrifierade i Cryoloop 21 Erhållna efter tining 22 Erhållna efter tining 21 Viabla efter tining 18 Degenererade efter tining 3 Viabla efter tining 18 Degenererade efter tining 2 Opåverkade 15 Fryspåverkade 3 Opåverkade 16 Fryspåverkade 2 Figur 5: Flödesschema över oocyterna i studien 17

18 Antal oocyter Totalt antal Viabla oocyter Opåverkade 2 0 Cryoloop GV Cryoloop MI Cryoloop MII Cryopette - GV Cryopette MI Cryopette MII Figur 6: Överlevnad och fryspåverkan hos oocyter i de olika grupperna samt i olika mognadsstadier Antal oocyter Totalt antal Viabla oocyter Vidareutvecklade 5 0 Totalt GV Cryopette - GV Cryoloop GV Totalt MI Cryoloop MI Cryopette MI Figur 7: Vidareutvecklade oocyter i de olika grupperna och mognadsstadierna. 18

19 DISKUSSION Ett av målen med projektet var att undersöka om vitrifering är en lämplig metod vid frysförvaring av oocyter. Resultaten visade att totalt 83,7% av de vitrifierade oocyterna överlevde 24 h efter uppvärmning. Detta kan tillsammans med tidigare gjorda studier [19, 20] peka på att vitrifiering är en bra metod för nedfrysning av oocyter. Det ska dock tilläggas att fertiliseringsgraden inte har undersökts i detta projekt, alltså kan det inte sägas något om hur oocyterna skulle klara av att utvecklas efter en befruktning. Det finns däremot andra studier som tyder på goda fertiliseringschanser efter vitrifiering, exempelvis presenterade Yoon et al en studie där man inte fann någon signifikant skillnad i fertilieringsgrad mellan frysta och färska oocyter.[21]. Då det endast ingår 43 oocyter i denna studie går det inte att dra några egentliga slutsatser om vilket system som är lämpligast. Exempelvis är oocyterna överblivna från den kliniska verksamheten och inte direkt avsatta för forskningen. Detta innebär att oocyterna inte har den kvalitet som egentligen skulle önskas, särskilt oocyterna i MII-stadiet är av nedsatt kvalitet. Dessa har underkänts för befruktning på grund utav avvikande morfologi. Fler och mer omfattande studier krävs för att med säkerhet kunna fastställa vilket system (Cryoloop och Cryopette) som ger bäst överlevnad efter vitrifiering. Utifrån våra resultat finns det ingen signifikant skillnad mellan systemen (P = 1,0), vilket har beräknats med Fishers exakta test. Cryoloop är ett väletablerat system och flera studier som gjorts med Cryoloop har givit goda resultat [22, 23], både gällande fertilisering och viabilitet efter vitrifiering. Studier är genomförda främst på embryon [22] men även för oocyter [24]. Den nackdel med systemet som brukar lyftas fram är handhavandet [18], då själva laddningen av Cryoloop kräver viss träning och vana. Resultat från vitrifiering med Cryoloop kan därför variera från person till person som utför vitriferingen, vilket kan 19

20 leda till lägre reproducerbarhet. Förutom vid laddandet av Cryoloop kan det vara komplicerat att försegla loopen i dess tillhörande cryorör. För att förhindra uppvärmning måste måste Cryoloopen monteras i röret under kväveytan, då ånga och bubblor från kvävet skymmer sikten kan det vara lätt hänt att Cryoloopen stöter mot kanten på cryoröret och droppen skadas. I värsta fall kan oocyten försvinna i kvävetanken och vara näst intill omöjlig att återfinna. Det ska dock tilläggas att efter träning på handhavandet är Cryoloop ett pålitligt och välbeprövat system som slagit ut många konkurrenter på marknaden. Cryopette å andra sidan är ett helt nytt än system, som precis blivit släppt på marknaden. Vid starten av projektet var dock produkten inte lanserad än, utan projektet har genomförts tillsammans med Origio MediCult som det första nordiska försöket med Cryopette. Cryopette är till skillnad från Cryoloop ett slutet system i vilket cellen inte kan gå förlorad vid själva nedfrysningen, förutsatt att Cryopetten blivit laddad och förseglad på korrekt sätt. Cellen kommer heller aldrig i direkt kontakt med kvävet vilket effektivt undanröjer problematiken med kontaminationsrisken i kvävet [15]. Cryopette är ett system som är lätt att lära sig använda. Då oocyterna pipetteras upp direkt med Cryopetten från vitrifieringslösningen är laddningsmomentet inte särskilt krävande. Det svåraste momentet med processen uppkommer vid tiningen då Cryopetten måste doppas ned i 37C vatten under 5 sekunder innan den kan öppnas, om detta moment skulle utebli kommer ett baksug uppstå i Cryopetten som fylls med luftbubblor. Detta beror på att luften i Cryopettens 'gummituta' komprimeras vid låga temperaturer. Det ska noteras att det inte finns några data på fertiliseringsgraden efter vitrifiering med Cryopette då det inte finns några publicerade studier i ämnet. Den största skillnaden mellan systemen är att Cryopette är öppet medan Cryoloop är slutet. Då denna studie antyder att systemen är likvärdiga gällande överlevnad efter vitrifiering, finns det goda 20

21 chanser för Cryopette att konkurrera med Cryoloop. Förutsatt att även fertiliseringsgraden visas likvärdig. I ett öppet system är kylningshastigheten högre än i ett slutet då vitrifieringslösningen kommer i direkt kontakt med kvävet, en snabb nedkylning minskar risken för att köldskador. Kylningshastigheten är de öppna systemens starkaste sida men då kontamination och borttappade oocyter och embryon är risker man helt vill utesluta från IVF-laboratorier är efterfrågan på ett slutet system som kan konkurrera med de väletablerade öppna systemen är stor. Ägg i GV- och MI-stadiet har fortfarande möjlighet att mogna ut till MII-oocyter efter att de plockats vid OPU så länge oocyterna förvaras i rätt odlingsmedium och i fysiologisk miljö [25]. I det här projektet har 17 av 18 överlevande GV-oocyter vidareutvecklats och 5 av 12 MI-oocyter, detta ser lovande ut särskilt med avseende på GV-äggen. Det är positivt för de oocyter som långtidsförvaras åt patienter som ska genomgå strålnings- eller cytostatikabehandlingar. I dessa fall finns det inte alltid tid att genomgå en fullständig hormonbehandling, varför det kan vara ett alternativ att göra ett kortare stimuleringsprotokoll och sedan frysa in de oocyter som plockas vid OPU oberoende av mognadsgrad. Projektet är även gjort på en begränsad mängd oocyter då tillgången på överblivna ägg har varit dålig. Fler oocyter och mer balanserad fördelning av mognadsstadier mellan Cryopette- och Cryoloopgruppen vore önskvärt. Anledningen till att fördelningen mellan grupperna är så ojämn beror främst på att upplägget av den delen av projektet har varit svårt att planera, då tillgången på oocyter har varierat kraftigt från vecka till vecka. Det beror även på att vitrifieringen med Cryopette påbörjades senare än nedfrysningen med Cryoloop och en stor del av Cryoloop-äggen redan var frysta när Cryopette började användas. Projektet har påvisat att oocyter kan vitrifieras och tinas med god överlevnadsgrad i MediCults 21

22 Cooling- och Warming medium. Protokollet fungerar bra för både Vitrolifes Cryoloop och MediCults Cryopette. I jämförelsen mellan Cryoloop och Cryopette har ingen signifikant skillnad mellan systemen kunnat påvisas gällande överlevnad och utmognad invitro för oocyter. Tackord Avslutningsvis skulle jag vilja tacka MediCult/Origio och främst Rita Skytte Offersen för den hjälp och det material som behövts för att genomföra studien. Tack även till Julius Hreinsson och Fatma Gülen Yaldir för handledning under projektets gång och till all personal på Reproduktionscentrum som hjälpt till med det här projektet. REFERENSER [1] Porcu E, Bazzocchi A, Notarangelo L et al. Human oocyte cryopreservation in infertility and oncology. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity 2008; 15: [2] Chen S, Yang Y. Slow freezing or vitrification of oocytes: their effect on survival and meiotic spindles, and the time schedule for clinical practise. Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology 2009; 1:15-22 [3] Tucker MJ, Morton PC, Wright G et al. Clinical application of human egg cryopreservation. Human Reproduction 1998; 13: [4] Porcu E, Fabbri R, Seracchioli et al. Birth of healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertility and Sterility1997; 68: [5] Gook DA, Edgar DH. Human oocyte cryopreservation. Human Reproduction Update 2007; 13: [6] Tao T, Del Valle A. Human oocyte and ovarian tissue cryopreservation and its application. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 2008; 25: [7] Hong SW, Chung HM, Lim JM, et al. Improved human oocytes development after vitrification: a comparison of thawing methods. Fertility and Sterility1999; 72: [8] Mandelbaum J, Belaisch-Allart J, Juncda AM et al. Cryopreservation in human assisteed 22

23 reproduction is now routine for embryos but remains a research procedure for oocytes. Human Reproduction 1998; 13: [9] Whittingham D, Leibo S, and Mazur P. Survival of Mouse Embryos Frozen to -196 and -269 C. Science 1972; 178: [10] Trounson A and Mohr L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature 1983; 305: [11] Boldt J, Tidswell N, Sayers A et al. (Abstract) Human oocyte cryopreservation: 5-years experience with a sodium-depleted slow freezing method. Reproductive BioMedicine Online 2006; 13: [12] Rall WF and Fahy GM. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature 1985; 313: [13] Kuleshova L, Lopata A. Vitrification can be more favorable than slow cooling. Fertility and Sterility 2002; 3: [14] Cao Y, Xing Q, Li L et al. Comparison of survival and embronic development in human oocytes cryopreserved by slow-freezing and vitrification. Fertility and Sterility 2009; 4: [15] Bielanski A and Vajta G. Risk of contamination of germplasm during cryopreservation and cryobanking in IVF units. Human Reproduction 2009; 24: [16] Pickering SJ, Braude PR, Johnson MH et al. Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte. Fertility and Sterility 1990; 54: [17] Ciotti PM, Porcu E, Notarangelo L et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility 2009; 6: [18] Gomes CM, Silva CA, Silva MS et al. Influence of vitrification on mouse metaphase II oocyte spindle dynamics and chromatin alignment. Fertility and Sterility 2008; 90: [19] Lucena E, Bernal D, Lucena C et al. Successful ongoing pregnancies after vitrification of oocytes. Fertility and Sterility 2006; 85: [20] Chen SU, Lien YR, Chao KH et al. Cryopreservation of mature human oocytes by vitrification with ethylene glycol in straws. Fertility an d Sterility 2000; 74:

24 [21] Yoon T.K, Kim T, Park S.E et al. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization embryo transfer program. Fertility and Sterility 2003; 79: [22] Takahashi K, Mukaida, Goto T et al. Perinatal outcome of blastocyst transfer with vitrification using cryoloop: a 4-year follow-up study. Fertility and Sterility 2005; 84:88-92 [23] Mukaida T, Nakamura S, Tomiyama T et al.vitrification of human blastocysts using cryoloops: clinical outcome of 223 cycles Human Reproduction 2003; 18: [24] Liebermann J and Tucker M.J. Effect of carrier system on the yield of human oocytes and embryos as assessed by survival and developmental potential after vitrification. Reproduction 2002;124: [25] Wu B, Tong J and Leibo SP. Effects of cooling germinal vesicle-stage bovine oocytes on meiotic spindle formation following in vitro maturation. Molecular Preproduction and Development 1999; 54: