Substratrecept Näringsberikade fasta substrat för isolering av aeroba och fakultativt anaeroba bakterier (blodagar, hematinagar och CLED-agar)

Transkript

1 BILAGOR 225

2 226

3 BILAGA 1 227

4 228

5 Substratrecept Urvalet av referenssubstrat i denna gula bok har följt principen att finna medier som effektivast möjligt understödjer växt av beskrivna mikroorganismer. Alla laboratorier måste inte nödvändigtvis använda just dessa substrat, även om det genom inventerande EQUAS-utskick kan konstateras att så sker i många fall. De enskilda laboratoriernas substratval följer traditioner baserade på lokala erfarenheter, kunskaper och uppfattningar. Tanken är att referenssubstraten därvid skall utgöra valideringsgrund vid det lokala substratvalet. Ett problem vid sådana valsituationer är att olika fabrikat av ett substrat med synbarligen samma recept (eller olika recept för den delen) kan ha olika egenskaper och fungera mer eller mindre väl. Betydande batchvariationer förekommer också. Det är alltså lämpligt att t ex. inför en upphandling jämföra angivet referenssubstrat mot en uppsättning av alternativa substrat där det förra inte nödvändigtvis är det som visar sig ha de bästa egenskaperna. För referenssubstraten anges firmanamn och katalognummer för spårbarhet till typrecept. Näringsberikade fasta substrat för isolering av aeroba och fakultativt anaeroba bakterier (blodagar, hematinagar och CLED-agar) Till blod- och hematinagar används specialkomponerade blodagarbaser som finns kommersiellt tillgängliga. I dessa ingår ofta skonsamt enzymdigererat kasein som tillhandahåller peptider och aminosyror med lågt kolhydratinnehåll och bibehållen hög halt av tryptofan. Det senare möjliggör test av indolreaktion. Extrakt av köttprotein ger ytterligare aminosyror, vitaminer, spårelement etc. Dessa komponenter är definierade i US Pharmacopeia. Tillsatt autolysat av bakjäst bidrar till snabb tillväxt och ger substraten goda differentierande egenskaper. Majsstärkelse absorberar toxiska metaboliter inklusive fria fettsyror vilket bidrar till säker tillväxt. Ett generellt problem med blodagarbaser är det relativt höga innehållet av reducerande kolhydrater vilket negativt påverkar den hemolytiska kapaciteten hos betastreptokocker. Columbia blodagarbas enligt Ellner et al (1966) är speciellt komponerad för snabb tillväxt och differentiering och relationen mellan ingående peptoner har avvägts så att streptokockernas förmåga att producera betahemolysin optimerats. Columbia blodagarbas är därför lämplig som referensbas för blodagar. Columbiablodagarbas och Blodagarbas II kan användas som bas för hematinagar (chokladiserad blodagar) avsedd att understödja växt också av Haemophilus- och Neisseria-arter. Emellertid utgör traditionellt Carpenter och Johnstons gc-agarbas 229

6 grundmedium i hematinagar. Denna bas skiljer sig från andra blodagarbaser genom något mindre agarmängd och fosfatbuffring. I kombination med hemoglobin och andra tillväxtfaktorer erhålls ett mycket näringsrikt medium som innehåller bland annat bundet oxiderat hem (hematin, X-faktor) och NAD (V-faktor). Hematinplattor med Gc-agarbas utgör därmed referenssubstrat, vilka också, till skillnad från andra hematinagartyper kan användas för resistensbestämning av gonokocker. 1. Blodagar Indikation: Substrat anrikat med hästblod för isolering av ett stort antal typer av aeroba och fakultativt anaeroba mikroorganismer samt olika gramnegativa stavar, Neisseria (ej gonokocker), stafylokocker, pneumokocker och streptokocker från kliniska prov. Princip: Columbia blodagarbas är ett välkomponerat grundmedium med bland annat kaseinhydrolysat och köttextrakt som kväve- och kolhydratkällor avsett att användas anrikat med 5-10 % valfritt blod. Vanligen används 5 % defibrinerat hästblod vilket ger distinkt betahemolys med olika streptokocker, vissa stammar av enterokocker och Listeria. Defibrinerat hästblod har ringa tendens att chelera metalljoner och ger ofta frodigare kolonier än om citratblod används. Många fabrikat av Columbia blodagarbas är inte avpassade för citratblod vilket också gäller referenssubstratet. Betahemolys orsakas av hemolys av de röda blodkropparna medan alfahemolys orsakas av att hemoglobinet i helt eller delvis intakta röda blodkroppar reduceras till methemoglobin. För blodagar avsedd för påvisande av betastreptokocker i svalgodlingar brukar istället 5-10 % fårblod rekommenderas, eftersom exempelvis enterokocker ofta inte ger betahemolys på sådant blod. Fårblod tenderar också att undertrycka normalflora, särskilt Haemophilus, mer än hästblod. Fårblodplattor kan gjutas dubbelskiktade för att underlätta avläsningen. Växtkarakteristika: (se tabell 14). På hästblodagar växer de flesta bakteriearter ut inom ett dygn. Kolonistorlek och utseende varierar kraftigt mellan olika arter trots att mediet inte i klassisk bemärkelse är differentierande. Flera bakteriearter uppvisar alfa- eller betahemolys, den senare med större säkerhet om plattorna inkuberas anaerobt. Ett flertal bakterietyper växer svagt eller inte alls på hästblodagar. Dit hör bland andra Haemophilus influenzae, Legionella och gonokocker. 230

7 Recept: (Columbia blodagarbas, Acumedia no 7125) Innehåll Gram/L Pankreasdigererat kasein 5,0 Köttextrakt 8,0 Jästanrikad pepton 10,0 Majsstärkelse 1,0 NaCl 5,0 Agar 14,0 ph 7,3 ± 0,2 vid 25 C Bered 5 % blodagar genom tillsats av sterilt, defibrinerat hästblod (alternativt fårblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar. 2. Hematinagar (Chokladiserad blodagar) Indikation: Näringsberikat medium för isolering av gonokocker, meningokocker och Haemophilus influenzae från kliniska prov. Resistensbestämning av gonokocker. Princip: Gc-agarbasbaserat medium som näringsberikas antingen med hemoglobin (torkat nötblod) och Isovitalex eller med hemolyserat hästblod och hästserum. Gc-agarbas utnyttjar som många andra blodagarbaser kaseinhydrolysat och köttextrakt som kväve- och kolhydratkälla. Reducerad agarmängd och fosfatbuffring bidrar till bättre och snabbare växt av framförallt gonokocker. Hemoglobin och Isovitalex (liksom lyserat hästblod och serum) tillför mediet bland annat X-faktor och V- faktor, en förutsättning för växt av H. influenzae, men bidrar också till god växt av Neisseria-arter. Hematinagar används också med tillsats av selekterande antibiotika (Modifierad Thayer-Martin-agar, VCNTsupplement) för isolering av gonokocker från kliniska prov. Växtkarakteristika: (se tabell 14). Meningokocker, gonokocker och Haemophilus växer inom ett dygn med feta blanka gråa kolonier, 0,5-2 mm. På hematinagar växer också inom ett dygn (ofta med kraftigare växt efter två dygn) pneumokocker och streptokocker med tydlig alfahemolys (gäller inte t.ex. GBS), stafylokocker (vita eller gulgråa kolonier), Listeria (stora matta platta 231

8 kolonier) och ett flertal arter av gramnegativa stavar (stora ofta råa kolonier). Candida albicans växer inom ett till två dygn med karakteristiskt stjärn- formade vita, matta kolonier. Recept: (Gc-agarbas, Acumedia no 7104) Innehåll Gram/L Pankreasdigererat kasein 7,5 Köttextrakt 7,5 Majsstärkelse 1,0 Di-kaliumfosfat 4,0 Mono-kaliumfosfat 1,0 NaCl 5,0 Agar 10,0 ph 7,2 ± 0,2 vid 25 C Tillred hematinagar genom tillsats av hemoglobinpulver 10 g och IsoVitaleX 10,0 ml enligt tillverkarens anvisningar. Recept: IsoVitaleX (BBL, no 11876) Innehåll Gram/L Vitamin B 12 0,1 L-glutamin 10,0 Adenin 1,0 Guanin HCl 0,03 p-aminobensoesyra 0,013 Nikotinamid-adenindinukleotid 0,25 Tiamin pyrofosfat 0,1 Järnnitrat 0,02 Tiamin HCl 0,003 L-cystein HCl 25,9 L-cystin 1,1 D-Glukos 100,0 232

9 3. Andra beredningsformer av blod- och hematinagar Ovanstående agarmedier utgör referenssubstrat. Dock kan andra beredningsformer förekomma på de enskilda laboratorierna. Det är därvid viktigt att validera dessa substrat mot referenssubstraten. Blodagar: Moderna kommersiella blodagarbaser har ofta goda egenskaper och är relativt likvärdiga. Alternativ till Columbia agarbas är Blodagarbas II. Det skall observeras att särskilt betahemolys kan påverkas beroende på vilken bas som väljs. Med Blodagarbas II erhålls utmärkt växt, men betahemolys kan bli odistinkt, dubbel, särskilt med fårblod. Recept: (Blodagarbas II, OX0ID, CM 271) Innehåll Gram/L Proteos pepton 15,0 Digererad lever 2,5 Jästextrakt 5,0 NaCl 5,0 Agar 12,0 ph 7,4 ± 0,2 vid 25 C Preparera 5 % blodagar genom tillsats av sterilt defibrinerat hästblod (alternativt fårblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar. Hematinagar: Sådan agar kan tillverkas med vilken blodagarbas som helst. Det skall observeras att endast hematinagar baserad på gc-agarbas lämpar sig för resistensbestämning av gonokocker. Recept: Hematinagar (alternativ för isolering av H. influenzae och Neisseriae) Columbia blodagarbas med tillsats av: Hästblod i lösning 8,5 % Normalserum från häst 5-10 % Tillverkas med chokladisering av blodet. 233

10 4. CLED-agar Indikation: Referenssubstrat för (i första hand) isolering av urinvägspatogener från urinprov, och Enterobacteriaceae vid allmän odling Princip: CLED är en förkortning av Cystein-Lactose-Electrolyt-Deficient utvecklat av Sandys och Mackey. Substratet är icke-inhibitoriskt men inte lika näringsrikt som blodagar. Innehåller såväl kaseinhydrolysat som köttextrakt och understödjer därmed växt av ett stort antal kliniskt relevanta bakterietyper. Karakteristiskt för detta substrat är avsaknaden av elektrolyter, vilket hindrar svärmning i första hand av Proteus. Mindre selektivt men för övrigt funktionellt nära saltfri McConkey-agar. Laktospositiva bakterier blir gula medan laktosnegtativa behåller mediets blåa grundfärg. Kontaminanter från urogenital flora (laktobaciller, mikrokocker och difteroider) växer ofta ut som mikrokolonier på plattan, vilket indikerar förorening. Växtkarakteristika: (se tabell 14). E. coli och andra gramnegativa bakterier växer inom ett dygn med relativt stora ( >2mm), opaka, blanka, släta kolonier. Laktospositiva bakterier blir gulfärgade, ofta med gult färgomslag i substratet. Grampositiva bakterier som stafylokocker och enterokocker växer med mindre, ofta gula kolonier ( 1-2mm). Growth index för de flesta bakterietyper nära de för blodagar. Recept: CLED-agar (enligt Mackey och Sandys, OXOID CM301) Innehåll Gram/L Pepton 4,0 Lab-Lemco pulver 3,0 Trypton 4,0 Laktos 10,0 L-cystein 0,128 Bromtymolblått 0,02 Agar 15,0 ph 7,3 ± 0,2 vid 25 C 234

11 Generella och selektiva näringsberikade fasta substrat för isolering av anaeroba bakterier från kliniska prov De flesta typer av kliniskt relevanta anaeroba bakterier växer bra på substrat baserade på blodagarbaser (exempel är Blodagarbas II, Columbiaagar, Brain-heartinfusion-agar, Schaedleragar, Tryptic soy agar, Brucellaagar etc.) om dessa anrikats med 5-10 % häst- eller fårblod, hemin och menadion (vitamin K). Tillsats av cystein bidrar till att sänka redoxpotentialen. Eftersom sådan blodagar också understödjer växt av ett flertal fakultativt anaeroba bakteriearter kan små mängder anaeroba bakterier förbises. Det är därför ofta lämpligt att genom antibiotikatillsats eller, genom applikation av t. ex. metronidazol och gentamicinlappar i primärstryket göra mediet selektivt för anaeroba bakterier. Alla dessa substratberedningar har relativt hög kolhydrathalt, varför betahemolys kan bli grönaktig. Brucellaagar är särskilt lämpad för isolering av gramnegativa stavar. Tillredningen av dessa berikade blodagartyper är relativt komplicerad vilket kan medföra variationer i den fortlöpande tillverkningen. Fastidious anaerobe agar (FAA, LabM) har valts som referenssubstrat eftersom grundberedningen innehåller alla de tillväxtbefrämjande komponenter som beskrivs ovan. FAA har i kliniska utvärderingar visat sig likvärdig eller bättre än Columbia-agarbaserad blodagar eller brain-heart-infusionagar. 5. Anaerob blodagar (FAA) Indikation: Substrat avsett för primär isolering av flera typer av kliniskt relevanta anaeroba bakterier från kliniska prov. Princip: Fastidious anaerobe agar (FAA) är en i grunden väl balanserad blodagarbas med speciell peptonmix som kväve- och främsta kolhydratkälla. Mediet innehåller stärkelse och bikarbonat vilka båda neutraliserar toxiska metaboliter. FAA innehåller också hemin och vitamin K, vilka utgör tillväxtfaktorer för ett flertal arter av anaeroba bakterier. Cystein sänker redoxpotentialen och pyruvat bidrar till neutralisering av väteperoxid. Substratet förstärks med 5 % hästblod, vilket förutom att bidra med ytterligare tillväxtfaktorer också möjliggör bedömning av hemolys. Växtkarakteristika: se tabell

12 Recept: Fastidious anaerobe agar (FAA, LABM Lab 90) Innehåll Gram/L Peptonmix 23,0 NaCl 5,0 Stärkelse 1,0 Agar no 2 12,0 Na-bikarbonat 0,4 Glukos 1,0 Na-pyruvat 1,0 Cystein HCl monohydrat 0,5 Hemin 0,01 Vitamin K 0,001 L-arginin 1,0 Pyrofosfat 0,25 Na-succinat 0,5 ph 7,2 ± 0,2 vid 25 C Kontrollstammar: se tabell 14. Tillred 5 % anaerob blodagar genom tillsats av sterilt defibrinerat hästblod enligt tillverkarens anvisningar. Vid utvidgad anaerob diagnostik är bruk av selektiv anaerob blodagar, referensmetod. FAA och andra medier kan göras selektiva för anaeroba bakterier genom antibiotikatillsats. Traditionellt används ofta så kallad kanamycin ( mg/l) vankomycin (7,5 mg/l) agar (referenssubstrat). Denna är selektiv för Bacteroides fragilis-gruppen och också lämpad för isolering av pigmenterade Prevotella species. Det skall dock observeras att flera Bacteroides-arter, Wolinella, fusobakterier, Bilophila och Porphyromonas liksom grampositiva anaerober ej växer på detta selektiva substrat. FAA med tillsats av neomycin, 100 mg/l (referenssubstrat) är särskilt lämpad för isolering av klostridier. Den inhiberar Enterobacteriaceae, men också vissa gramnegativa anaerober. 236

13 6. Andra beredningsformer av anaerob blodagar Ovanstående anaerob FAA-blodagar utgör referenssubstrat. Andra beredningsformer kan förekomma. Vid lot-inköp är det viktigt att validera alternativen mot referenssubstratet. Vanligt alternativ till FFA-agarbas är näringsberikad Brucellaagar med 5-10 % hästblod. Recept: (Brucellaagar, Acumedia no 7120) Innehåll Gram/L Digererat kasein 10,0 Pepsindigererad djurvävnad 10,0 Jästextrakt 2,0 NaCl 5,0 Glukos 1,0 Na-bisulfit 0,1 Agar 15,0 ph 7,2 ± 0,2 vid 25 C Bered anaerob blodagar genom tillsats av cysteinhydroklorid 0,5 g/l, hemin 5 mg/l och vitamin K 1 mg/l vid max 50 C. Samtidigt tillsätts defibrinerat hästblod till 5 % i anaerob blodagar. Beredningen av selektiv agar som ovan för FAA. 237

14 Flytande substrat för anrikning av aeroba och anaeroba bakterier Dessa substrat är avsedda för mikrobiell anrikning av kliniska prov som innehåller få eller enstaka bakterier. Beredningarna är komponerade för att anrika flera olika typer av aeroba och anaeroba bakterier. Aeroba buljonger kan ha kasein- och sojabönshydrolysat (Tryptic soy broth, TSB-buljong) som kväve- och kolhydratkälla. Alternativ är buljong baserad på pepton från köttextrakt (Nutrient broth nr2) eller infusion från hjärna och hjärta (brain-heart-infusion, BHI- buljong). Buljongerna understödjer växt av de flesta aerobt växande organismer utom Haemophilus och Neisseriae. Näringsberikning är därför nödvändig när dessa bakterier misstänks och anrikning önskas (ej referensmetodik). TSB berikad med Fildes supplement och inaktiverat hästserum rekommenderas (ej referenssubstrat). Fildes supplement utgörs av pepsindigererat, syra- och alkalibehandlat defibrinerat häst- eller fårblod, och innehåller ett flertal olika tillväxtfaktorer inklusive fritt hemin (X-faktor) och koenzym (V-faktor) för växt av Haemophilus och meningo- och gonokocker. Fritt hemin är toxiskt för streptokocker inklusive pneumokocker. Denna effekt neutraliseras genom tillsats av 5-10 % inaktiverat hästserum, motsvarande mängd albumin eller aktivt kol. Det finns ett antal bra anaeroba buljonger vilka dock inte är lämpade för anrikning av gonokocker och meningokocker (se ovan). Ett traditionellt basmedium som ofta rekommenderas är cooked meat medium (CM-buljong). Detta är särskilt effektivt för långtidsförvaring av anaeroba bakterier. Tyvärr är CM-buljongen även i kommersiella beredningar något komplicerad att bereda vilket kan leda till variationer i den fortlöpande tillverkningen. Växtsätt av olika bakterietyper framträder heller inte tydligt med denna buljong. Andra medier är Schaedler-buljong, näringsberikad BHI och olika typer av tioglykollatbuljonger där fastidious anaerobe broth (FAB, LabM) är i klass med CM-buljong och utgör referenssubstrat för anrikning av kliniska prov. Valet av denna buljong baseras bland annat på förmågan att anrika även anaeroba bakterier i aerob miljö och ett tydligt typrecept. FAB har i sin grundberedning tillsatser av L-cystein, Na-tioglykollat och en liten mängd agar som bidrar till att hålla buljongen tillräckligt anaerob även i aerob miljö. 7. Anaerob anrikningsbuljong (FAB) Indikation: För anrikning av ett stort antal kliniskt relevanta aeroba och anaeroba bakterier från kliniska prover och eventuellt transport av kliniska prover. Princip: FAB är ett mycket näringsrikt substrat baserat på speciell peptonmixtur som kväve- och kolhydratkälla och med jästextrakt som näringstillskott. L-cystein och Na-tioglykollat bidrar till att reducera buljongen. Små 238

15 mängder agar bidrar till att bibehålla anaerobios (redox-indikator resazurin, rosa färgomslag i översta buljongskiktet indikerar aerob miljö där men för övrigt anaerob miljö i röret). Till skillnad från andra tioglykollatbuljonger och CM-buljong är hemin och menadion tillsatta redan till grundberedningen. Trots goda egenskaper uppvisar FAB liksom övriga anaeroba buljongtyper ofta svag växt av fusobakterier och anaeroba grampositiva kocker, vilka kan kräva tre till sju dygns inkubationstid. För optimal anaerobios rekommenderas i viss litteratur inkubering i anaerob miljö, men de flesta kliniskt relevanta anaeroba bakterier växer utmärkt även vid aerob inkubering. Därvid växer obligat anaeroba bakterier i rörets nedre del. Obligat aeroba bakterier växer bara i ytskiktet medan fakultativt anaeroba och aerotoleranta anaerober växer i hela buljongen. Enterobacteriacae tenderar att svärma diffust i mediet medan de flesta andra bakterietyper växer utefter inokulationssticket eller intill provmaterialet. Neisseriae liksom vissa streptokockisolat växer dåligt eller inte alls. Växtkarakteristika: Se bilaga 2 och tabell 14. Recept: Tioglykollatbuljong-FAB (LabM, LAB 71 ) Innehåll Gram/L Peptonmixtur 5,0 Jästextrakt 10,0 NaCl 2,5 L-cystein 0,5 Na-tioglykollat 0,5 Agar no 1 0,75 Resazurin 0,001 Na-bikarbonat 0,4 Hemin 0,005 Vitamin K 0,0005 ph 7,2 ± 0,2 vid 25 C 239

16 8. Alternativ aerob anrikningsbuljong (TSB) Indikation: För anrikning av ett stort antal typer av aeroba och fakultativt anaeroba bakteriearter (utom Haemophilus, meningo- och gonokocker) från kliniska prov (ej referensmetod). Princip: I sin grundberedning är TSB ett mycket näringsrikt medium som är lämpat för anriking av en mångfald olika bakterietyper i små mängder (i synnerhet streptokocker). Tillsats av Fildes supplement ger mediet tillgång till extra tillväxtfaktorer, inkluderande hemin (X-faktor) och koenzym (Vfaktor). Därmed kan också små mängder av Haemophilus och meningooch gonokocker anrikas inför sekundär utodling. Samtidig tillsats av inaktiverat 5-10 % hästserum är därvid nödvändig för att bibehålla buljongens generella egenskaper. Dessa tillsatser höjer dock priset avsevärt (ca 10-falt), varför anrikad buljong bara rekommenderas för situationer där sådana bakterier speciellt misstänks. Fildes supplement kan ersättas av 0,1-1 % Isovitalex och hemoglobin (innehåller bundet, därmed atoxiskt hematin) varvid serumtillsats ej är nödvändig. Recept: (Tryptic soy broth, TSB, Acumedia no 7164) Innehåll Gram/L Pankreasdigererat kasein 17,0 Papaindigererat sojabönsmjöl 3,0 NaCl 5,0 Di-Kaliumfosfat 2,5 Glukos 2,5 ph 7,3 ± 0,2 vid 25 C Vid beredning av näringsberikad TSB ( Fildes buljong ) tillsätts Fildes peptic digest of blood (Oxoid, SR46) ml till 1000 ml TSB. Detta gör buljongen svagt rökfärgad men fortfarande genomskinlig. Buljongen balanseras genom tillsats av inaktiverat hästserum ml till 1000 ml TSB. Alternativt tillsätts 0,1-1,0 % Isovitalex (BBL) och 0,1-1,0 % bovint hemoglobinpulver (OXOID, L53). Kontrollstammar: se tabell

17 Övriga substrat 9. Fenolmannitagar (FM-agar) Indikation: För isolering av stafylokocker från kliniska prov och preliminär identifiering av S. aureus (ej referensmetod i denna bok). Princip: FM-agar (utan antibiotika) är modifierad efter G H Chapmans ursprungliga rekommendationer av agarmedium med hög salthalt för selektiv isolering av stafylokocker med differentiering av S. aureus genom dessas förmåga att jäsa mannit. Observera att även vissa stammar av koagulasnegativa stafylokocker kan jäsa mannit. Selektivitet för stafylokocker uppnås genom hög koncentration av NaCl (7,5 %), en nivå som utesluter växt av praktiskt taget alla övriga humanpatogena bakterier med undantag för Vibrio. Grundfärg ljust röd på grund av närvaro av indikatorn fenolrött. Vid jäsning av mannit gulfärgas kolonier och mediet runt dessa. Påvisande av gelatinhydrolys (Stone-reaktion på gelatinhaltigt medium) hos S. aureus kräver media med lägre salthalt (5,5 % NaCl, Chapman-Stone-medium). Växtkarakteristika: S. aureus växer inom 24 tim med matta, släta gulvita kolonier ca 1 mm i diameter med gulfärgad zon i mediet runt kolonierna. Vissa stammar av koagulasnegativa stafylokocker kan ha samma växtsätt, men ofta är dessas kolonier vita. Föga växt av andra bakterietyper. Recept: Fenolmannitagar (Mannitol-Salt Agar, OXOID CM85) Innehåll Gram/L Lab-Lemco pulver 1,0 Pepton 10,0 Mannit 10,0 NaCl 75,0 Fenolrött 0,025 Agar 15,0 ph 7,5 ± 0,2 vid 25 C 241

18 10. Selektiv fenolmannitagar (MS-agar) Indikation: Selektiv isolering av meticillinresistenta stafylokocker i kliniska prov. Princip: Detta medium (MSA) skiljer sig från FM-agar genom lägre salthalt (3 %) för optimal sensitivitet avseende meticillinresistenta S. aureus. Selektivitet för stafylokocker bibehålls genom tillsats av litiumklorid som hämmar gramnegativa bakterier. Selektivitet för meticillinresistenta stafylokocker uppnås genom tillsats av t.ex. oxacillin 1 mg/l. Recept: Selektiv fenolmannitagar (Mast Diagnostic DM 160) Innehåll Gram/L NaCl 30,0 Mannit 10,0 Pepton 8,0 Jästextrakt 2,0 Laktalbumin 3,0 Litiumklorid 7,0 Glycin 1,0 Na-pyruvat 3,0 Fenolrött 0,025 Agar 12,0 ph 7,4 ± 0,2 vid 25 C Selektiv fenolmannitagar bereds genom tillsats av t.ex. oxacillin (LabKemi, TAB/OX-0,1) 0,1 mg tabletter till 100 ml medium. Se för övriga aktuella rekomendationer RAFs hemsida 242

19 11. Selektiv anrikningsbuljong för betahemolyserande streptokocker (här använd som GBS-buljong ) Indikation: För anrikning av GBS i pinnprov från vagina och andra lokaler samt från odlingar på nyfödda. Princip: Todd-Hewitt-buljong (THB) formulerades ursprungligen för produktion av hemolysiner från streptokocker. Buljongen fungerar också utmärkt för anrikning av streptokocker och enterokocker och för odling inför serologisk gruppering. Detta näringsrika medium baserat på infusion av kött är speciellt buffrat för att bibehålla ett neutralt ph trots mikrobiell växt. THB liksom vissa fasta substrat som Columbia blodagar och Islamagar kan göras selektiv för betahemolyserande streptokocker genom tillsats av antibiotika. Vanligen tillsätts därvid gentamicin och nalidixinsyra (referensbuljongen). Vissa målbakterier inhiberas dock av denna kombination varför andra selektiva antibiotikakombinationer prövats. Colistin och nalidixinsyra (LIM-buljong) rekommenderas därvid av CDC, men kombinationen colistin+oxolinsyra kan med fördel användas eftersom denna effektivt inhiberar även stafylokocker. För att optimera GBS-buljongen anger vi här reducerad mängd gentamicin 2 mg/l (istället för 8 mg/l) och nalidixin 15 mg/l. Recept: Todd-Hewitt-buljong (OXOID, CM 189) Innehåll Gram/L Infusion av kött 10,0 Trypton 20,0 Glukos 2,0 NaCl 2,0 Di-Na-fosfat 0,4 Na-karbonat 2,0 ph 7,8 ± 0,2 vid 25 C THB-buljongen tillreds enligt tillverkarens anvisningar. GBS-buljong bereds genom tillsats av gentamicin 2 mg/l och nalixinsyra 15 mg/l. Alternativt ersätts gentamicin med colistinsulfat mg/l. Nalidixin kan ersättas med oxolinsyra 5 mg/l. Eventuellt kan 5 % fårblod tillsättas för att ytterligare berika buljongen. Kontrollstam : GBS CCUG 4208, se också tabell

20 12. Selektiv anrikningsbuljong för vankomycinresistenta enterokocker (VRE) Den beredning som idag används är identisk med den selektiva Todd-Hewitt buljong som beskrivs ovan som GBS -buljong med användande av gentamicin (2 mg/l) och nalidixinsyra (15 mg/l). Selektivitet för VRE uppnås genom tillsats av vankomycin 32 mg/l. Kontrollstammar: E. faecalis ATCC (vanko-s) och E. faecium CCUG (vanko-r, van A-typ). Se också tabell 14, bilaga

21 13. Transportsubstrat för bakteriologiska pinnprov Olika typer av transportsubstrat avsedda för kliniskt bakteriologiska prov tagna med fiberarmerad provtagningspinne finns kommersiellt tillgängliga. Vi anger Amies kolade transportmedium (fabrikat Copan, Brescia, Italien) som referenssubstrat. Provtagningspinnarna är försedda med rayon (spunnen cellulosa)- tops och finns i olika grovlekar för olika provlokaler. I certifierad batchprövning ingår ett flertal bakteriearter med angiven överlevnadstid för ett flertal bakterietyper på minst 24 timmar. Recept: Amies kolade transportmedium (Copan, Venturi Transystem, Brescia, Italien) Innehåll Gram/L Charcoal 10,0 NaCl 3,0 Na-vätefosfat 1,15 K-dikvävefosfat 0,2 KCl 0,2 Na-tioglykollat 1,0 CaCl 2 0,1 MgCl 2 0,1 Agar 4,0 ph 7,2 ± 0,2 vid 25 C 245

22 REFERENSER: Blomgren E, Larsson M and Sjöberg L.. Comparative study of the bacteriological performance of commercial Amies agar swab transport devices with a traditional Stuart agar transport system. ASM 101 st General meeting, Orlando, Florida Poster session 29. Eley, A et al. Comparative growth of Bacteroides species in various anaerobic culture media. J Med Microbiol. 1985; 19: Ellner, PD et al. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 1966; 45: Ganguli, LA et al. Evaluation of fastidious anaerobe broth as a blood culture medium. J Clin Pathol. 1982; 35: Gästrin B, Kallings L O and Marcetic A. The survival time of different bacteria in various transport media. Acta Path Microbiol Scand. 1968; 74: Heginbothom, M et al. Comparison of solid media for cultivation of anaerobes. J Clin Pathol. 1990; 43: Hunt G and Price, EH. Comparison of a homemade blood culture broth containing a papain digest of liver, with four commercially available. J. Clin Pathol. 1982; 35: Kahlmeter G / Smyth R Mackey J P and and Sandys G H. Diagnosis of urinary Infections. BMJ. 1966; May: 1173 Mason E O et al. Evaluation of four methods for detection of group B streptococcal colonization. J Clin Microbiol. 1976; 4: Petts DN. Colistin-oxolinic acid-bloodagar: a new selective medium for streptococci. J Clin Microbiol. 1984; 19: 4-7. Stalons D R et al. Effect of Culture medium an Carbon dioxide concentration on growth of anaerobic bacteria commonly encountered in clinical specimens. Appl Microbiol. 1974; 27: Thayer J. D. and Martin, J. E. Improved medium selective for cultivation of N. gonorrhoeae of N. meningitidis. Publ Health Reports. 1966; 81: Waterworth, P. M. The stimulation and inhibition of the growth of Haemophilus influenzae on media containing blood. B J Exp Pathol. 1955; 36: Welch, D. F. et al. Comparative evaluation of selective and nonselective culture techniques for isolation of group A beta-hemolytic streptococci. Am J Clin Pathol. 1991; 95:

23 BILAGA 2 247

24 248

25 Substratkontroll Ett stort antal olika generella, näringsberikade, selektiva, differentierande eller speciella media finns kommersiellt tillgängliga. Dessa är som regel noggrant specificerade och kvalitetskontrollerade av producenten, vilken på begäran bifogar analyscertifikat över aktuell lot. Detta innehåller uppgifter bl.a. om komposition, fysiologiska egenskaper, odlingsegenskaper med olika referensstammar, förvaring etc. enligt tillgängliga standarder, t.ex. NCCLS Doc M22-A. Trots detta föreligger skillnader mellan olika fabrikat; det kan exempelvis gälla den allmänna kompositionen av Columbia blodagarbas. Sådana skillnader kan ha betydelse för understödjande växt av olika bakteriearter men också påverka differentierande egenskaper som hemolys etc. Variationer förekommer också mellan olika tillverkningsloter (batcher) av samma substrat, större ju mer komplext substratet är. Vid det enskilda laboratoriet är sedan variationer vid den fortlöpande tillverkningen inom en och samma lot oundvikliga. Testförfarande inför upphandling av fasta substrat, referensmetod Inför upphandling av generella näringsberikade substrat (blod-, hematin-, anaerob blodagar) skall dokumenterad jämförelse göras mellan pågående lot och prov från nya loter från en eller flera leverantörer. Loterna jämförs med avseende på allmänna växtkarakteristiska, såväl in vitro med referensstammar som i det praktiska arbetet med kliniska prov. En av loterna väljs därefter. Det är därvid lämpligt att sprida renkulturer av föreslagna referensstammar slammade i PBS så att fria bedömbara kolonier erhålls. Alternativt används samma metod som för selektiva substrat (se nedan). Upphandling av selektiva substrat (t.ex. MacConkeyagar) eller sådana avsedda för semikvantitativ odling (CLED-agar) skall jämföras med lämplig uppsättning målbakterier (sådana som förväntas växa bra) och kontaminater (sådana som inhiberas).vid sådan jämförelse rekommenderas samma metod som beskrivs i upplaga 2 av referensmetodik för infektioner i mag-tarmkanalen (SMI tryck ). Även dessa substrat skall jämföras mot pågående lot i det praktiska arbetet med kliniska prov. Testförfarande vid den fortlöpande tillverkningen av fasta substrat, referensmetod Den fortlöpande tillverkningskontrollen skall dokumenteras och följer principerna för lot-jämförelserna. Dock kan ett mindre batteri av testbakterier användas för granskning av vissa nyckelegenskaper hos respektive substrat. Även selektiva substrat kan därvid testas med granskning av renspridda kolonier. 249

26 Testförfarande vid upphandling och fortlöpande tillverkning av anrikningsbuljonger Vid testning av tioglykollat (FAB)-buljong är lämpligt urval av referensstammar B. fragilis CCUG 4856, Cl. perfringens CCUG 1795, F. nucleatum CCUG , P. aeruginosa CCUG 551, E. coli CCUG och S. aureus CCUG Vid testningen inokuleras spädda kulturer av respektive bakteriestam i buljongen. För godkännande av batch krävs växt inom timmar, den senare tidpunkten gäller fusobakterier, och typiskt växtsätt vid aerob inkubering indikerande god anaerobios på djupet och aerob miljö i ytskiktet. E. coli förväntas svärma i hela mediet. Metod 1. Färska övernattskulturer på agarplatta späds i aerob PBS till McFarland 0,5-1,0. 2. Stegvis spädning ned till ca 10 2 CFU/10 µl (10 4 CFU för fusobakterierna). 3. Inokulera rören (10 ml buljong i varje) med 10 2 CFU i 10 µl plastinös som sticks ner mot botten. Mixa ej. 4. Sprid för insåddskontroll på lämpliga agarplattor, inkubera på lämpligt sätt. 5. Inkubera rören timmar i 36 o C i luft. 6. Notera växt och växtsätt (se figur 9). Fig. 9 Växt i FAB. Pseudomonas utgör exempel på aerob, E. coli på fakultativt anaerob, B. fragilis och Clostridium perfingens på anaerob växt. (Foto; Najah Samaan) 250

27 Aeroba buljonger (TSB med Fildes, GBS-buljong, VRE-buljong) skall kunna anrika små mängder av olika typer av mikroorganismer. Lämpligt urval för TSB med Fildes är S. pneumoniae CCUG 33774, S. pyogenes CCUG 33061, E. coli CCUG 17620, P. aeruginosa CCUG 551 och H. influenzae CCUG GBSbuljong och VRE-buljong testas med samma metod och kontrollstammar angivna under respektive recept. Metod: 1. Färska övernattskulturer späds i PBS till McFarland 0, Stegvis spädning i 10-potenssteg ned till ca 10 CFU/10 µl PBS. 3. Tillsätt till rören (5 ml buljong i varje) 10 CFU och 100 CFU i 10 µl PBS, respektive. 4. Sprid för insåddskontroll på lämpliga agarplattor. 5. Inkubera övernatt i 36 C i luft och sprid därefter 10 µl från varje rör på lämpliga agarplattor. 6. Resultatet bedöms acceptabelt om anrikning skett i något av rören för varje mikroorganism. 251

28 252

29 BILAGA 3 253

30 254

31 Tabell 14. Rekommenderade referensstammar och växtkarakteristika för vissa substrat 255

32 256

33 Tabell 14a. Rekommenderade referensstammar och växtkarakteristika för vissa substrat Inkubation Förväntad växt Substrat Mikroorganism ATCC CCUG Temp, ºC Miljö Tid (Dygn) Växt Inhibition Ø mm Yta Form Färg Omslag agar Hemolystyp Anmärknig Blodagar (Columbiaagarbas, 5 % hästblod) E. coli X 3-4 Halvblank Rund/ kupad S. aureus X 1-2 Matt Rund/ kupad S. pneumoniae aerob 1 X <1 Blank Rund/ platt S. pyogenes X 1 Halvmatt Rund/ platt Gul/ Grå Vit Grö n Grö n Alfa Vit Klar Beta Betahemolys i aerob miljö Krav! Hematinagar (gc-agarbas Hemoglobin+ ISO VitaleX) N. gonorrhoeae alt 0041 X 1 Blank Rund/ kupad N. meningitidis X 2 Blank Rund/ Gul/ kupad Grå H. influenzae % CO 2 1 X 0,5- Halvblank Rund/ Grå alt platt S. pneumoniae X 1 Blank Mukoid S. aureus X 1-2 Blank Gul/ Grå E. coli X >2 Halvblank Rå Gul/ Grå 257 Grå Grö n Alfa

34 Tabell 14 b. Rekommenderade referensstammar och växtkarakteristika för vissa substrat Inkubation Förväntad växt Substrat Mikroorganism ATCC CCUG Temp, ºC Miljö Tid (Dygn) Växt Inhibition Ø mm Yta Form Färg Omslag agar Hemolystyp Anmärknig Anaerob blodagar (FAA +5 % hästblod) B. fragilis X 1-2 Blank Konvex C. perfingens X >2 Blank Platt, rå F. nucleatum anaerob 1-3 X 1-2 Matt Konvex P. aeruginosa X Grå blå Grå beta svärmande CLED E. coli X 2 Blank Konvex, Gul Gult slät P. mirabilis X 1-3 Blank Platt Blå Får ej Salm. Typhimurium aerob 1 X 1-2 Blank Konvex, slät E. faecalis 9997 X 0,5-1 Blank Konvex S. aureus X 0,5-1 Blank Konvex Blå Gul Gul svärma 258

35 Tabell 14 c. Rekommenderade referensstammar och växtkarakteristika för vissa substrat Inkubation Förväntad växt Substrat Mikroorganism ATCC CCUG Temp, ºC Miljö Tid (Dygn) Växt Inhibition Ø mm Yta Form Färg Omslag agar Hemolystyp Anmärknig Anaerob anrikningsbuljong (FAB) GBS-buljong VRE-buljong Fildes buljong (TSB med Fildes peptic digest of blood) B. fragilis X C. perfingens X aerobt F. nucleatum X 36 eller P. aeruginosa X Växt vid ytan anaerobt E. coli X Diffus växt S. aureus X GBS 4208 X aerobt S. pyogenes X 36 (ev E. coli X CO S. aureus ) X E. faecalis X vankos E. faecium aerobt X vana-gen S. pneumoniae X S. pyogenes X E. coli aerobt 1 X P. aeruginosa X H. influenzae X 259

36 260

37 BILAGA 4 261

38 262

39 Extern kvalitetssäkring: Bakteriologisk odlingsdiagnostik/allmän odling EQUALIS 9742/ Panelen var sammansatt på uppdrag av referensgruppen för sårodlingar som ett led i arbetet med referensmetodik. Syftet var dels att studera laboratoriernas ambitionsnivå vid isolering samt taxonomisk begreppsapparat dels att beskriva tolkning och svarsrutiner vid olika anamnestyper. Materialet bestod av fem prov ( ) innehållande aeroba och anaeroba bakterier i renkultur eller i blandning. Varje prov skulle ställas mot fyra anamneser samma för varje prov. Panelen var gjord vid SMI (Lena Lindberg, Marianne Kjellgren och Hans Hallander). Proven innehöll följande bakterier: 9742/115 Proteus mirabilis CCUG Stenotrophomonas maltophilia CCUG Staphylococcus lugdunensis CCUG Streptococcus constellatus CCUG Bacteroides fragilis CCUG /116 Propionibacterium acnes CCUG Staphylococcus epidermidis CCUG Corynebacterium pseudodiphtheriticum CCUG Entercoccus faecium CCUG /117 Peptostreptococcus magnus CCUG /118 Streptococcus agalactiae/grupp B CCUG Escherichia coli CCUG Pseudomonas aeruginosa CCUG /119 Staphylococcus aureus CCUG Enterococcus faecium CCUG Escherichia coli CCUG Enterobacter cloacae CCUG

40 Resultat Antal deltagande laboratorier: 31 Resultatredovisningen görs i två delar. Först ges laboratoriernas odlingsresultat varvid alla svar beaktats. Därefter hur fynden rapporteras med hänvisning till de olika anamneserna och i samband därmed också rutiner för resistensbestämning. 9742/115 Proteus mirabilis, CCUG Proteus mirabilis 29 Proteus species 2 31 Stenotrophomonas maltophilia, CCUG Stenotrophomonas maltophilia 18 Pseudomonas maltophilia 1 Gramnegativ stav ej Enterobacteriaceae 1 20 Staphylococcus lugdunensis, CCUG Staphylococcus lugdunensis 10 KNS 13 Staphyloccocus epidermidis 1 Staphyloccocus aureus 5 29 Streptococcus constellatus, CCUG (9742/115) Streptococcus milleri 7 Streptococcus constellatus 4 Streptococcus anginosus 1 Streptococcus intermedius 4 Alfastreptokocker 9 Streptococcus agalactiae 1 Streptococcus species 2 28 Bacteroides fragilis, CCUG Bacteroides fragilis 11 Bacteroides fragilis-gruppen 9 Bacteroides species 3 Överväxt proteus /

41 Propionibacterium acnes, CCUG Propionibacterium acnes 15 Propionibacterium species 2 17 Staphylococcus epidermidis, CCUG Staphylococcus epidermidis 6 KNS Corynebacterium pseudodiphtheriticum, CCUG Corynebacterium pseudodiphtheriticum 2 Corynebacterium species 5 Difteroida stavar 8 15 Enterococcus faecium, CCUG Enterococcus faecium 25 Enterokocker 3 Alfastreptokocker /117 Peptostreptococcus magnus, CCUG Peptostreptococcus magnus 11 Peptostreptococcus species 9 Peptokocker 3 anaeroba streptokocker 4 anaeroba grampos kocker /118 Streptococcus agalactiae/gbs, CCUG Streptococcus agalactiae 31 Escherichia coli, CCUG E. coli 29 Citrobacter 1 Proteus mirabilis 1 31 Pseudomonas aeruginosa, CCUG Pseudomonas aeruginosa 28 Oxidaspos gramneg stav /119 Enterococcus faecium, CCUG

42 Enterococcus faecium 26 Enterococcus species 3 Enterococcus casseliflavus 1 Enterococcus gallinarium 1 31 Staphylococcus aureus, CCUG Staphylococcus aureus 26 Staph. spec/kns 5 31 Escherichia coli, CCUG Escherichia coli 10 Enterobacter cloacae, CCUG Enterobacter cloacae 23 Enterobacter species 4 Enterobacter sakazaki 1 28 Kommentar Kvantitering: En grov kvantitering efter skalan rikligt-måttligt-sparsamt görs av 8 laboratorier. Stafylokocker: Aureusstafylokockerna i blandkultur med enterokocker och gramnegativer (119) har ej noterats i 5 fall. Däremot har en Staphylococcus lugdunensis (115) i 5 fall betecknats som Staphylococcus aureus. Verifieringsrutiner? Enterokocker/streptokocker: Enterococcus faecium förekom i såväl 116 som 119 och har klassifierats som korrekt species av 26 laboratorier vilket sannolikt är av visst nosokomialt intresse. Svårigheten är inte oväntat större beträffande den s.k. millerigruppen (115). 7 laboratorier använder denna beteckning medan fyra Streptococcus constellatus, ett Streptococcus anginosus och fyra Streptococcus intermedius. Fyra lab nöjer sig med alfastreptokocker och ett anger Streptococcus agalactiae. Verifieringsrutinerna inom denna sektor borde diskuteras. Streptococcus agalactiae (118) vållade inga problem. Aeroba gramnegativa stavar:det kan synas anmärkningsvärt att E.coli icke uttrycks korrekt i två fall och Pseudomonas aeruginosa inte givits korrekt speciesbeteckning i tre. Enterobacter cloacae har givits rätt speciesbeteckning av 23 laboratorier och Stenotrophomonas maltophilia av 18. Anaerober: 266

43 Peptostreptokockerna som presenterades i renkultur (117) isolerades av samtliga laboratorier medan Bacteroides fragilis (115) som förekom i blandkultur med bl.a. proteus endast noterats i 23 fall. Propionibacterium acnes (116) isolerades och namngavs av 17 laboratorier. Här skymdes bilden av KNS och difteroida stavar. Tolkning. Fyra anamneser angavs och laboratorierna ombads att för var och en av anamneserna använda de 5 proven för att belysa svarsrutiner och tolkning. Anamnes b används här som exempel på laboratoriernas olika rutiner. Anamnes a: 59-årig man med fistelbildning 3 veckor efter höftledsoperation. Pinnprov. Anamnes b: 63-årig kvinna med venöst bensår. Måttligt rodnande sårkanter och ökad sekretion. Pinnprov. Res Ej i svar Påvisad totalt 115 Proteus Stenotrophomonas gramneg stav 1 1 Staphylococcus lugdunensis KNS aureus 4 5 Streptococcus constellatus anginosus 1 1 intermedius agalactiae 1 1 species 1 2 α strep Bacteroides fragilis species Propionibacterium acnes species 1 2 Staphylococcus epidermidis 5 6 KNS Corynebacterium pseudodiphth 2 2 dift stavar 8 13 Enterococcus faecium enterokocker 2 3 α strep

44 Res Ej i svar Påvisad totalt Peptostreptococcus magnus peptokocker 3 3 species Streptococcus agalactiae E. coli Pseudomonas aeruginosa oxpos g-stav Staphylococcus aureus species (KNS) Enterococcus faecium species 3 5 E. coli Enterobacter cloacae species 3 5 Exempel på kommentarer (prov 115): Lågpatogen blandflora x 2, Gramnegativ blandflora, KNS och α strep, Koliform blandflora, KNS (+res), Bacteroides (+res), Proteus, Bacteroides, KNS, α strep, gramnegativ stav, proteus, Blandflora, Staphylococcus lugdunensis (+res), Bacteroides (+res), Blandflora, Bacteroides fragilis (+res), Gramnegativ blandflora, strep spec, hudflora, Blandflora. 268

45 Anamnes c: 6-årig flicka. Infekterat operationssår efter appendektomi. Rodnad sårkant vid suturtagning hos distr. sköt. Pinnprov. Anamnes d: 40-årig man. Cytostatikabehandlad leukemi med oklar feber. Pinnprov från perineum. Allmänna Kommentarer: Anaerobodling utförd för samtliga anamneser av 19 deltagare, anamnes a av 31 deltagare, anamnes b av 22 deltagare (9 utför ej anaerob odling), anamnes c av 29 deltagare (2 utför ej anaerob odling), anamnes d av 24 deltagare (7 utför ej anaerobodling), Anaerobodling utförs ej vid anamnes b och d av 3 deltagare, Anaerobodling utförs ej vid anamnes b och c och d av 1 deltagare, Anaerobodling utförs ej vid anamnes d av 3 deltagare. Resistensbestämning utförd som % av samtliga redovisade fynd: Anamnes a 87% (378/433), Anamnes b 29% (125/433), Anamnes c 56% (242/433), Anamnes d 62% (268/433). 269

46 Kommentar från expertgruppen för medicinsk mikrobiologi avseende bakteriologisk odlingsdiagnostik/allmän odling EQUALIS 9742/ Proven innehöll, med ett undantag, blandfloror. Detta utskick var betydligt mer komplicerat uppbyggt än vanligt. Avsikten med de olika anamneserna var, som tidigare påpekats, att ge ett underlag för den referensgrupp som arbetar med att ta fram en gul bok om sårodlingar. Några aspekter att lyfta fram är: 1. Alla de 31 laboratorierna anger inte alla bakterieslagen. Detta gäller främst S. maltophilia, B. fragilis, P. acnes och C. pseudodiphtheriticum. I prov 119 hade endast 10/31 lab angivit E. coli. 2. Diagnostiken av S. lugdunensis (prov 115) utgör ett problem. 3. Benämningarna av vissa bakterier varierar. Främst gäller det S. millerigruppen men även t.ex. Enterococcus, Peptostreptococcus och Enterobacter hanteras olika. 4. Anaerobodling utfördes vid anamnes a av alla 31 laboratorierna och vid alla fyra anamneserna hos 19 lab. 5. Resistensbestämningar utfördes mellan 87 och 29 % av alla fynd beroende på anamnes. Urvalet av antibiotika varierar mycket mellan laboratorierna. RAF/RAF-Ms rekommendationer om minimiurval tycks inte ha fullt genomslag. Bedömningen av odlingsprov som innehåller en blandning av bakterier med högre och lägre virulens är bland det svårare inom klinisk bakteriologi. Den subjektiva bedömningen och kommentarernas olika utformning i svaret medverkar till variation i svaren, vilket denna EQUALIS-omgång illustrerar. Fortsatta diskussioner inom arbetsgruppen för sårodlingar och RAF/RAF-M ger anledning att återkomma i ärendet. För expertgruppen Peter Larsson 270